概述

      Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化生成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中會發(fā)出生物熒光。然后通過熒光測定儀可以測定該生物熒光的強(qiáng)度。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)。是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。

其原理簡述如下：

（1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。

（2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。

（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

實(shí)驗(yàn)流程

（1） 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

（2）設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。

（3）篩選陽性克隆，測序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。

（4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照，提純備用。

（5） 培養(yǎng)293（或其它目的細(xì)胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時(shí)（80%匯合度）。

（6） 將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。

（8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。

（9） 計(jì)算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較。

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