一、劃痕實驗

 

細胞劃痕實驗是一種簡單易行的檢測細胞運動的方法，實驗成本低，可以用來檢測貼壁生長腫瘤細胞的侵襲轉移能力。

 

實驗內容：
 

材料：6 孔板（其他多孔板亦可，但6孔較好，大小適中）、marker筆、直尺、20微升槍頭（滅菌）、無血清培養基、PBS
 

步驟：所有操作器械都要提前滅菌，直尺和marker筆在操作前用紫外照射30min（超凈臺內）

1．先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。

2．在孔中加入約5X105個細胞，具體數量因細胞大小及特性的不同來設定，掌握為過夜能鋪滿孔板為宜。

3．第二天用槍頭比著直尺進行劃痕，直尺盡量垂直于背后的橫線，槍頭要垂直，不能傾斜。

4．用PBS洗3次，去除劃落的細胞，然后加入無血清培養基。

5．放入37度5% CO2培養箱中進行培養。之后按0，6，12，24小時取樣，拍照。

 

注意事項：

1. 一般做劃痕實驗，都是在無血清或者低血清狀態下培養的，否則細胞本身的增殖情況就不能忽略。

 

2. 按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點，這就解決了前后觀察時位置不固定的問題。

 

 

二、Transwell檢測遷移

 

細胞遷移與侵襲實驗將Transwell小室放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。

 

實驗步驟：

 

1. 材料準備：

可拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8μm，沒包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用)，Transwell遷移實驗的細胞培養板24孔板。細胞培養板應當與購買的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，無血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培養基，DMEM完全培養基，1640完全培養基（也可加到20%血清），無菌PBS，棉簽，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS結晶紫）

 

2. 步驟和流程：

2.1基質膠鋪板：

用BD公司的Matrigel 1：8（根據細胞產生mmp的量來決定）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。

2.2制備細胞懸液

 

①制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

②消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的無血清培養基重懸。調整細胞密度至5×105/ml。

2.3接種細胞

①取細胞懸液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%PBS的培養基，特別注意的是，下層培養液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板。

③培養細胞：常規培養12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。24h較常見，時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。

2.4結果統計

直接計數法，“貼壁”細胞計數，這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去，通過給細胞染色，可在鏡下計數細胞。

1. 取出Transwell小室，棄去孔中培養液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當風干。

2. 0 .1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3遍。

3. 400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞，記數。

 

 

 

三、 Transwell檢測侵襲

 

transwell侵襲實驗就是用一層膜將高營養的培養液和低營養的培養液隔開，細胞放在低營養的培養液里，細胞會往高營養的培養液方向移動。應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。

 

實驗內容：

 

（1）共培養體系：

小于3.0um孔徑條件下，細胞不會遷徙通過，因此，若研究不涉及細胞運動能力，不需要細胞穿過聚碳酸酯膜，則應選擇3.0µm以下孔徑。常用0.4、3.0µm。我們實驗室用的是0.4µm。將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產生的物質對細胞A的影響。

（2）趨化性實驗

 可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室細胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室，計數進入下室的細胞量可反映下室成分對上室細胞的趨化能力。
 ①細胞B對細胞A的趨化作用：將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產生的物質對細胞A的趨化作用。
 ②趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對細胞的趨化作用。

（3）腫瘤細胞遷移實驗

 常用8.0、12.0µm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。

（4）腫瘤細胞侵襲實驗常用8.0、12.0µm膜，原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。

 

在聚碳酸酯膜上涂上一層基質膠，模仿細胞外基質，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或實驗設定的藥物或者影響因子，細胞會分泌相關酶類消化模擬細胞外基質膜的基質膠，從而從上室遷移到下室，通過計數進入下室的細胞量測定細胞的侵襲能力。

 

實驗圖片示例：