簡介

    細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。

    細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現象，而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。

漢恒為您提供如下細胞凋亡檢測服務

一、流式細胞儀檢測細胞凋亡——Annexin V/PI 雙染色法

基本原理

    細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結合蛋白，最初發現是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于結合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。

實驗步驟

(1) 用 PBS 洗細胞培養板兩次，然后用胰酶消化，1000 rpm 離心 5 min，棄去培養液

(2) 各管加入 10 mL PBS，輕柔地懸浮細胞，洗細胞兩次

(3) 計數1x105細胞放入100ul  1X Binding Buffer，放入1.5ml EP管

(4) ANNEXIN V 5ul先孵育20min，再加入PI 3ul 再孵10min，室溫避光

(5) 加入400ul Binding Buffer,流式細胞儀分析細胞凋亡情況

二、TUNEL

基本原理：

    TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結合，后者又與HRP底物二氨基聯苯胺（DAB）反應產生很強的顏色反應（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。

操作流程圖：

實驗步驟

1）、清洗：移去完全培養基，用 PBS 清洗一次細胞。 

2）、固定：用 4％的多聚甲醛在室溫固定 15 分鐘。 

3）、清洗：用 PBS 在室溫漂洗三次，每次 10 分鐘。 

4）、破膜：用含 0.1%Triton-X-100 的 PBS 在室溫通透化處理 15 分鐘。 

5）、清洗：用 PBS 在室溫漂洗三次，每次 10 分鐘。 

6）、封閉：用含 5%山羊血清（BSA）的 PBS 在室溫封閉 1 小時。 

7）、清洗：TBST室溫漂洗三次，每次10分鐘。

8）、TUNEL溶液配制：Enzyme Solution和Label Solution以1：10混勻，避光備用，注意試劑用量，試劑盒價格昂貴，避免浪費。

9）、標記：用上訴配好的溶液，約20ul每張玻片，室溫避光孵育10分鐘，

10）、清洗：用PBS在室溫漂洗三次，每次 10 分鐘。 

11）、DAPI染核：加入 DAPI 染色液 1：2000 室溫孵育 5 分鐘。 

12）、清洗：用PBS 在室溫漂洗三次，每次 10 分鐘。 

13）、封片：用封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察結果，免疫熒光照片用蔡司共聚焦顯微鏡。

14）、TUNEL positive dot 計算方法：DAPI和TUNEL positive dot 通過image pro軟件，計算DAPI的陽性點作為細胞總數，TUNEL陽性點作為tunel點，最后計算 TUNEL/DAPI×100%作為凋亡細胞的比率。

實驗實例