在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力（cell viability）。細胞活力測定方法有MTT法、克隆（集落）形成法、臺盼藍染色法、3H放射性同位素摻入法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復(fù)性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如CCK-8（WST-8）、XTT等。結(jié)合實際每種方法的優(yōu)缺點，漢恒生物目前提供以下幾種服務(wù)。每種實驗服務(wù)均有所不同，詳細請聯(lián)系漢恒生物的技術(shù)服務(wù)人員400-092-0065。

 

MTT

 

    MTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑藍為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量僅與活細胞數(shù)目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。

    MTT粉末和配置好的溶液都需要用鋁箔紙包好避光保存。實驗的時候盡量關(guān)閉超凈臺上的日光燈進行避光操作。

 

 

步驟如下：

1：接種細胞：用含10％胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔 1000－10000個細胞的密度接種到96孔板中，每孔體積200ul.

2：培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵�求決定培養(yǎng)時間）。

3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul. 繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。

4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標來繪制細胞生長曲線。

 

注意事項：

（1）選擇適當?shù)募毎�接種濃度。

（2）避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

（3）設(shè)空白對照：與試驗平行，不加細胞只加培養(yǎng)液的孔設(shè)為空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。

 

CCK8

 

Cell Counting Kit簡稱CCK8試劑盒，是一種基于WST-8（化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

WST-8屬于MTT的升級產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在490mM波長處測定OD值，間接反映活細胞數(shù)量。

 

實驗步驟(以下為藥物處理實例)

1、在96孔板中配置100μL的密度為2×104個/ml的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時（37℃，5% CO2）。

2、按一下濃度梯度和時間點，加藥物處理;

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段時間（0-7天共8個時間點）。

4、向每孔加入10μL CCK8溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)。

5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1小時。

6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

 

 

    通常研究藥物毒性時會涉及半抑制率，即IC50，,意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。

 

 

BrdU摻入實驗

 

    溴脫氧尿嘧啶核苷是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競爭摻入S期細胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU與胸腺嘧啶競爭摻入的強溴脫氧尿嘧啶核苷是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競爭摻入S期細胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU與胸腺嘧啶競爭摻入的強度可能與細胞增殖異常有關(guān)，如肝癌細胞約11.6%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝細胞僅有1.1%。

   既往在分子遺傳學等研究中常采用同位素標記，但有放射污染，技術(shù)難度大，實驗周期長等缺點。近年來非放射性標記物的研究發(fā)展迅速，然而其敏感性多數(shù)不及同位素，使實驗應(yīng)用受限。自82年Gratzer制備出抗BrdU單抗及標記檢測技術(shù)不斷改良提高，應(yīng)用BrdU標記的敏感性已與氘胸腺嘧啶核苷相似。目前認為BrdU是最有希望取代同位素的非放射性標記物之一。

 

詳細步驟：

第1天

1. 用100μM的BrdU工作液（用5mg/ml的儲存液以6μL/mL稀釋而成）標記細胞。 胚胎干細胞，30分鐘 ；3T3細胞，2.5小時 ；二倍體成纖維細胞，4－6小時。

2. 胰酶消化細胞，用PBS洗脫，400×g或1700rpm離心5分鐘，去上清，加入10 mL 70% EtOH重懸。

3. 保存在－20℃過夜或數(shù)天。

第2天

1. 將第一天的標本離心去上清，并用洗滌緩沖液（PBS + 0.5% IFS）洗滌。

2. 離心去上清，以0.5 mL 2M HCl + 0.5% IFS （Keratin intermediate filaments (IFs)必須新鮮配制！），室溫孵育20分鐘。

3. 加入1ml洗滌緩沖液洗滌細胞。

4. 離心去上清，以0.1M的四硼酸鈉（Na2B4O7）重懸細胞，室溫孵育2分鐘。

5. 用1ml洗滌緩沖液洗滌細胞2次（分出一部分細胞用于PI單染，見第10步）

6. 用50μL洗滌緩沖液重懸細胞，加入anti-BrdU抗體，4℃孵育20分鐘。

7. 加入1.5ml洗滌緩沖液洗一次。

8. 用50μL洗滌緩沖液重懸細胞，加入用于封閉Fc段的抗體（如FITC-conjugated rabbit anti-mouse (F(ab')2 fragments等），4℃孵育20分鐘。

9. 加入1.5ml洗滌緩沖液洗滌一次。

10. 以0.3ml PI（10μg/ml）重懸細胞，室溫孵育30分鐘。準備上機。

 

 

克隆形成實驗colony forming assay

 

    細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。

（1）、培養(yǎng)分選的兩組細胞，取對數(shù)生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。進行一代克隆形成率檢測時，進入步驟（2）；進行二/三代克隆形成率檢測，須再經(jīng)此方法再培養(yǎng)一/二代，再取對數(shù)期細胞，進入步驟（2）。

（2）、將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。

（3）、經(jīng)常觀察，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

（4）、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率。

    克隆形成率 =（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%