Western blot檢測服務

 

 

蛋白印跡 (Western Blot) 是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法，用于檢測經電泳或斑點雜交后固定于膜上的蛋白質。特異、穩定的液態酶標抗體和相應底物，保證了快速、準確的檢測，并且避免了放射性物質的使用。現已成為蛋白分析的一種常規技術，對蛋白進行定性和半定量分析。

 

Western blot技術的一般步驟是將經過SDS-PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。由于Western blot檢測技術結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，因此可檢測到1-5 ng (最低可到10-100 pg)中等大小的靶蛋白。同時，Western blot技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

 

 

 

 

技術優勢

 

（1）高效蛋白提取液進行高質量蛋白的提取，同時高效的蛋白酶抑制劑有效防止蛋白的降解及去磷酸化等作用；

 

（2）漢恒生物擁有多年的Western Blot檢測經驗，為客戶提供專業的技術服務。

 

（3）漢恒生物為客戶設置預實驗，根據客戶樣品具體情況摸索最適上樣量和抗體最適稀釋度。

 

 

樣品要求

 

客戶需提供新鮮或正確保存的蛋白樣品或者蛋白提取液，陽性對照樣品（細胞或組織）， 檢測目的蛋白的一抗（或由漢恒生物代購）。樣品要求為：

 

1、細胞不少于5×106個；

 

2、組織樣品不少于50mg；

 

3、總蛋白濃度不低于 2μg/μl（至少50μl）。

 

 

 

實驗內容

 

 

1、蛋白提取和定量（如果提供蛋白樣品，則直接電泳預實驗檢測抗體特異性）；

2、SDS-PAGE 10-15% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；

3、轉膜（PVDF膜）；

4、封閉（5%脫脂奶粉）；

5、一抗孵育（其中內參基因為Tubulin、GAPDH或Actin）；

6、二抗孵育（如果由于材料降解或一抗造成實驗無法繼續，則收取相關預實驗費用）；

7、顯色（ECL）；

8、曝光、洗片、分析。

 

 

 

提供產品內容

 

 

蛋白濃度，掃描圖，以及灰度分析（如果需要）及完整實驗報告。

 

 

 

注意事項

 

 

每張膜上做一種目的蛋白和相應的內參蛋白。每張膜上可以做8個樣品。一般狀況下，2周即可完成實驗。如遇特殊情況，如一抗不好，蛋白濃度低或蛋白特殊，如分子量大等，周期會有所延長。

 

 

 

 

Western Blot細胞蛋白樣本的準備及運輸

 

 

去掉培養液，用PBS洗一次后，加入少量PBS，用細胞刮將細胞刮下，用1ml槍吸取細胞易于1.5ml EP管中，快速離心（升至最高轉速就可stop）去除上清后，可按下面兩種方法運輸：

 

1、細胞干運輸：將細胞干放入液氮速凍，-80℃保存; 如需長途過夜運輸，建議干冰運輸；如當天送達樣本，可用液氮或者-80冰袋運輸。

 

2、細胞裂解液運輸：加入一定量的胞裂解液后即可冷藏運輸（冰袋或者冰盒）。如需檢測磷酸化蛋白，建議裂解液中加入終濃度1mM的NaF，NaF可抑制磷酸酶活性，保護蛋白磷酸化水平。如果加入裂解液后提取蛋白，則置于冰上裂解1 h，12000rpm離心10 min后取上清，即為蛋白樣本。蛋白樣本可-20度冷藏運輸（建議快遞寄送用干冰或者足量-80度冰袋），保存需要-80℃。

 

3、蛋白樣本運輸

注意：蛋白樣本需要經過濃度測定，再進行變性，變性時先加入Sample buffer，再95℃ 10 min，Sample buffer可防止變性導致的蛋白沉淀析出。變性的蛋白可直接冷藏運輸，-20℃穩定保存。

 

 

 

Western Blot實驗服務結果實例圖

 

 

 

 

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