禽病原料-禽傳染性支氣管炎N蛋白的結構與表達系統
瀏覽次數:34 發布日期:2025-7-13
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一、蛋白結構
1.
天然 N 蛋白結構
- 三維構象:天然 N 蛋白是 IBV 核衣殼的主要組成蛋白,以同源二聚體形式包裹病毒基因組 RNA,形成螺旋狀核衣殼結構。其結構分為:
- N 端結構域(NTD,1-130 位氨基酸):富含精氨酸(R)和甘氨酸(G),形成帶正電荷的 RNA 結合區,通過靜電作用與病毒基因組 RNA 結合。
- 中心疏水區(131-230 位氨基酸):包含 α- 螺旋和 β- 折疊交替的結構,參與二聚體形成及核衣殼組裝。
- C 端結構域(CTD,231-411 位氨基酸):高度保守,含多個抗原表位,通過與病毒包膜蛋白(M 蛋白)相互作用,介導核衣殼與病毒包膜的結合。
2.
重組 N 蛋白結構特點
- 線性抗原表位豐富:重組 N 蛋白的抗原表位多為線性表位(如 30-45、150-165、350-365 位氨基酸),構象依賴性較低,因此原核表達系統即可有效呈現抗原活性。
二、分子量
- 天然 N 蛋白:由 411-422 個氨基酸組成(不同毒株略有差異),理論分子量約為 46-48 kDa,無糖基化修飾,實際分子量與理論值接近。
- 重組 N 蛋白:不同表達系統中分子量一致,約 46-48 kDa,可通過 SDS-PAGE 驗證(條帶位置清晰,無顯著修飾導致的分子量偏移)。
三、蛋白特性
1.
抗原性與免疫原性
- 群特異性抗原:N 蛋白是 IBV 最保守的結構蛋白,其抗原表位在不同血清型(如 M41、H120、QX 型)中高度保守,可用于 IBV 通用型診斷(如 ELISA、膠體金檢測)。
- 免疫反應靶點:感染后宿主產生的抗 N 蛋白抗體雖無中和病毒作用,但可作為 IBV 感染的血清學標志物(如 IgM/IgG 檢測)。
2.
穩定性與可溶性
- 高穩定性:N 蛋白富含 α- 螺旋和 β- 折疊,結構緊湊,耐蛋白酶降解,4℃可穩定保存數月,-20℃可長期保存。
- 可溶性優勢:在原核系統中易可溶性表達(尤其在大腸桿菌 BL21 菌株中),極少形成包涵體,無需復雜復性工藝。
3.
功能特性
- RNA 結合能力:NTD 區域的 RGG 基序(精氨酸 - 甘氨酸 - 甘氨酸重復序列)可特異性結合病毒基因組 RNA 的 5’端非翻譯區(UTR),參與病毒復制和轉錄。
四、純化方式
根據重組 N 蛋白的表達形式(可溶性 / 包涵體),常用純化方法如下:
1. 原核表達系統(大腸桿菌,最常用)
- 表達形式:可溶性表達于細菌裂解液上清中,或少量以包涵體形式存在。
- 純化流程:
- 破菌:超聲或溶菌酶處理破碎細菌,4℃離心收集上清液(可溶性蛋白)或沉淀(包涵體)。
- 親和層析(首選):
- 若蛋白融合 His-tag,通過 Ni-NTA 柱純化:平衡液(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.4)沖洗,200-500 mM 咪唑洗脫目標蛋白,純度可達 90% 以上。
- 若融合 GST-tag,用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂純化,還原型谷胱甘肽洗脫。
- 離子交換層析(精純):利用 N 蛋白的電荷特性(等電點 pI 約 9.0,帶正電荷),通過陽離子交換柱(如 SP Sepharose)進一步去除雜蛋白,優化純度至 95% 以上。
- 濃縮與脫鹽:超濾離心(10 kDa 截留分子量)濃縮蛋白,PBS 緩沖液透析脫鹽,-80℃凍存前可添加 5% 甘油防止凍融變性。
2. 真核表達系統(酵母 / 桿狀病毒)
- 純化流程:
- 分泌型表達:酵母(如畢赤酵母)或昆蟲細胞培養上清液經離心澄清后,直接通過親和層析純化(流程同原核),無需破菌步驟。
- 細胞內表達:桿狀病毒感染昆蟲細胞后,裂解細胞收集蛋白,純化步驟與原核類似,但需注意真核細胞雜蛋白的去除(如通過疏水層析輔助純化)。
3. 包涵體純化(僅適用于少量聚集蛋白)
- 若 N 蛋白以包涵體形式表達,需用 8M 尿素溶解,Ni-NTA 柱純化后,通過梯度透析(尿素濃度從 8M→0M)復性,同時加入 10% 甘油促進蛋白正確折疊,復性效率可達 60%-70%。
五、表達系統對比
表達系統優點缺點適用場景
大腸桿菌
成本低、表達量高(100-500 mg/L)、可溶性好
無糖基化修飾(但 N 蛋白無需修飾)
診斷抗原(ELISA、膠體金)、科研抗體制備
畢赤酵母
可分泌表達、操作簡便、翻譯后修飾簡單
表達量中等(50-100 mg/L)
需少量糖基化的 N 蛋白(如結構研究)
桿狀病毒 - 昆蟲細胞
天然構象更接近、可與其他病毒蛋白共表達
成本高、周期長(7-10 天)
病毒樣顆粒(VLP)組裝研究、多蛋白互作分析
哺乳動物細胞(CHO)
修飾最完整(如磷酸化)
成本極高、表達量低
高端科研(如 N 蛋白與宿主因子互作)
六、純化效果驗證
- SDS-PAGE:重組 N 蛋白在 46-48 kDa 處呈現單一清晰條帶,純度≥90%(考馬斯亮藍染色)。
- Western blot:可與 IBV 陽性血清發生特異性反應,證實抗原表位正確性。
- ELISA:包被重組 N 蛋白后,可高效捕獲 IBV 感染血清中的抗體,OD 值(450 nm)≥2.0(陰性對照 OD≤0.1)。
IBV 的 N 蛋白因其結構保守、抗原性穩定及可溶性表達優勢,成為 IBV 檢測與科研的理想靶點。原核表達系統(大腸桿菌)因低成本、高表達量成為首選,配合 Ni-NTA 親和層析即可獲得高純度蛋白;真核系統(如酵母、桿狀病毒)則用于特殊需求(如分泌表達、結構研究)。純化后的 N 蛋白可廣泛應用于 IBV 的血清學診斷(如抗體檢測試劑盒)、疫苗佐劑研究及病毒復制機制解析,為 IB 防控提供關鍵工具。