禽病原料-禽法氏囊病毒重組VP2蛋白的結構、特性及純化方式
瀏覽次數:33 發布日期:2025-7-13
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一、蛋白結構
1.
天然 VP2 蛋白結構
- 三維構象:天然 VP2 蛋白是 IBDV 衣殼的主要組成部分,以同源二聚體或三聚體形式組裝成病毒衣殼表面的突起結構,其空間構象依賴于多個二硫鍵(如 Cys229 與 Cys247、Cys317 與 Cys329)的穩定作用。
- 功能區域:
- 高變區(HR):位于氨基酸殘基 214-284 區域,包含多個抗原決定簇(如 222、242、253、256 位氨基酸),是病毒與中和抗體結合的關鍵位點,也是毒株變異的熱點區域。
- 保守區:如 N 端(1-100 位氨基酸)和 C 端(300-411 位氨基酸),參與病毒衣殼組裝及宿主細胞受體結合(如與衰變加速因子 DAF 結合)。
2.
重組 VP2 蛋白結構特點
- 構象模擬:通過桿狀病毒表達系統等真核表達體系生產的重組 VP2 蛋白,可形成類似天然病毒的構象依賴性抗原表位;而原核表達(如大腸桿菌)的 VP2 蛋白常以包涵體形式存在,需復性處理以恢復空間結構。
二、分子量
- 天然 VP2 蛋白:由 426 個氨基酸組成,理論分子量約為 47 kDa,但由于糖基化修飾(如 N 端第 21、24 位天冬酰胺的糖基化),天然 VP2 蛋白的實際分子量在 55-60 kDa 之間。
- 重組 VP2 蛋白:分子量因表達系統而異:
- 真核表達(桿狀病毒):糖基化修飾較完整,分子量接近天然蛋白(55-60 kDa)。
- 原核表達(大腸桿菌):無糖基化修飾,分子量約為 47 kDa,需通過質譜或 SDS-PAGE 驗證。
三、蛋白特性
1.
抗原性與免疫原性
- 中和表位核心:重組 VP2 蛋白包含 IBDV 的主要中和抗原表位(如 194-214、249-295 位氨基酸區域),可誘導宿主產生高效中和抗體,保護法氏囊免受病毒攻擊。
- 構象依賴性:其抗原活性高度依賴空間構象,線性表位(如 200-210 位氨基酸)與構象表位(如 250-260 位氨基酸形成的環區)共同決定抗體結合效率。
2.
穩定性與可溶性
- 真核表達:桿狀病毒系統表達的重組 VP2 蛋白可溶性高,可分泌至培養基中,穩定性較好(4℃可保存數周)。
- 原核表達:大腸桿菌表達的 VP2 蛋白易形成包涵體,需通過變性劑(如 8M 尿素)溶解后復性,可溶性及活性較低,需優化表達條件(如低溫誘導、分子伴侶共表達)。
3.
變異與抗原漂移
- VP2 高變區氨基酸突變(如 256 位 Asn→Ile、222 位 Ser→Asn)可導致抗原性改變,是 IBDV 突破疫苗免疫的主要機制。
四、純化方式
根據重組 VP2 蛋白的表達系統與存在形式,常用純化方法如下:
1. 真核表達系統(以桿狀病毒為例)
- 表達形式:分泌型表達于昆蟲細胞培養基中,或存在于細胞裂解液中。
- 純化流程:
- 澄清:離心或過濾去除細胞碎片,收集上清液。
- 親和層析:利用重組 VP2 蛋白 C 端融合的標簽(如 His-tag、GST-tag)進行鎳柱(Ni-NTA)或谷胱甘肽瓊脂糖親和純化,特異性結合目標蛋白。
- 離子交換層析:進一步去除雜蛋白,優化純度(純度可達 95% 以上)。
- 濃縮與復性:通過超濾離心濃縮蛋白,若存在少量聚集物,可通過透析復性處理。
2. 原核表達系統(大腸桿菌)
- 表達形式:多以包涵體形式存在于細菌沉淀中。
- 純化流程:
- 破菌:超聲或高壓均質破碎細菌,離心收集包涵體。
- 溶解:用 8M 尿素或 6M 鹽酸胍溶解包涵體,加入還原劑(如 DTT)破壞錯誤折疊的二硫鍵。
- 親和純化:His-tag 標記的 VP2 蛋白通過 Ni-NTA 柱純化,洗脫液含高濃度咪唑。
- 復性:梯度透析去除變性劑,同時加入氧化還原對(如 GSH/GSSG)促進二硫鍵正確折疊,復性后通過凝膠過濾層析(如 Superdex 系列)去除聚集體。
3. 純化效果驗證
- SDS-PAGE 與 Western blot:檢測分子量及純度,重組 VP2 蛋白在凝膠中呈現單一清晰條帶(真核表達約 55 kDa,原核表達約 47 kDa)。
- ELISA 與中和試驗:驗證抗原活性,重組 VP2 蛋白需能特異性結合 IBDV 陽性血清,并誘導中和抗體產生。
五、不同純化方式的對比
純化方法優點缺點適用場景
親和層析(Ni-NTA)
特異性高,操作簡便,適合初純化
依賴標簽,可能影響蛋白活性
各類表達系統的初步純化
離子交換層析
可去除電荷差異的雜蛋白,提升純度
需優化緩沖液 pH 及離子強度
精純階段(如疫苗抗原制備)
凝膠過濾層析
按分子量分離,可去除聚集體
處理量低,耗時較長
復性后蛋白的精細純化
親和層析 + 復性(原核)
可從包涵體中回收蛋白
復性效率低,易導致蛋白失活
大腸桿菌表達的重組 VP2 蛋白
重組 VP2 蛋白的結構與分子量直接影響其抗原活性,而純化方式的選擇需結合表達系統特性(真核 / 原核)與應用場景(診斷 / 疫苗)。真核表達系統(如桿狀病毒)因糖基化修飾完整、可溶性高,成為疫苗用重組 VP2 蛋白的首選;原核表達則需通過復雜復性工藝恢復活性,更適合科研或低成本診斷抗原制備。純化后的重組 VP2 蛋白需通過多維度驗證,確保其結構完整性與免疫原性,為 IBD 防控提供有效工具。