• 三維構(gòu)象：天然 VP2 蛋白是 IBDV 衣殼的主要組成部分，以同源二聚體或三聚體形式組裝成病毒衣殼表面的突起結(jié)構(gòu)，其空間構(gòu)象依賴于多個二硫鍵（如 Cys229 與 Cys247、Cys317 與 Cys329）的穩(wěn)定作用。
• 功能區(qū)域： 
  • 高變區(qū)（HR）：位于氨基酸殘基 214-284 區(qū)域，包含多個抗原決定簇（如 222、242、253、256 位氨基酸），是病毒與中和抗體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，也是毒株變異的熱點(diǎn)區(qū)域。
  • 保守區(qū)：如 N 端（1-100 位氨基酸）和 C 端（300-411 位氨基酸），參與病毒衣殼組裝及宿主細(xì)胞受體結(jié)合（如與衰變加速因子 DAF 結(jié)合）。

• 構(gòu)象模擬：通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)等真核表達(dá)體系生產(chǎn)的重組 VP2 蛋白，可形成類似天然病毒的構(gòu)象依賴性抗原表位；而原核表達(dá)（如大腸桿菌）的 VP2 蛋白常以包涵體形式存在，需復(fù)性處理以恢復(fù)空間結(jié)構(gòu)。

• 天然 VP2 蛋白：由 426 個氨基酸組成，理論分子量約為 47 kDa，但由于糖基化修飾（如 N 端第 21、24 位天冬酰胺的糖基化），天然 VP2 蛋白的實際分子量在 55-60 kDa 之間。
• 重組 VP2 蛋白：分子量因表達(dá)系統(tǒng)而異： 
  • 真核表達(dá)（桿狀病毒）：糖基化修飾較完整，分子量接近天然蛋白（55-60 kDa）。
  • 原核表達(dá)（大腸桿菌）：無糖基化修飾，分子量約為 47 kDa，需通過質(zhì)譜或 SDS-PAGE 驗證。

• 中和表位核心：重組 VP2 蛋白包含 IBDV 的主要中和抗原表位（如 194-214、249-295 位氨基酸區(qū)域），可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高效中和抗體，保護(hù)法氏囊免受病毒攻擊。
• 構(gòu)象依賴性：其抗原活性高度依賴空間構(gòu)象，線性表位（如 200-210 位氨基酸）與構(gòu)象表位（如 250-260 位氨基酸形成的環(huán)區(qū)）共同決定抗體結(jié)合效率。

• 真核表達(dá)：桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組 VP2 蛋白可溶性高，可分泌至培養(yǎng)基中，穩(wěn)定性較好（4℃可保存數(shù)周）。
• 原核表達(dá)：大腸桿菌表達(dá)的 VP2 蛋白易形成包涵體，需通過變性劑（如 8M 尿素）溶解后復(fù)性，可溶性及活性較低，需優(yōu)化表達(dá)條件（如低溫誘導(dǎo)、分子伴侶共表達(dá)）。

• VP2 高變區(qū)氨基酸突變（如 256 位 Asn→Ile、222 位 Ser→Asn）可導(dǎo)致抗原性改變，是 IBDV 突破疫苗免疫的主要機(jī)制。

根據(jù)重組 VP2 蛋白的表達(dá)系統(tǒng)與存在形式，常用純化方法如下：

• 表達(dá)形式：分泌型表達(dá)于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中，或存在于細(xì)胞裂解液中。
• 純化流程： 
  • 澄清：離心或過濾去除細(xì)胞碎片，收集上清液。
  • 親和層析：利用重組 VP2 蛋白 C 端融合的標(biāo)簽（如 His-tag、GST-tag）進(jìn)行鎳柱（Ni-NTA）或谷胱甘肽瓊脂糖親和純化，特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白。
  • 離子交換層析：進(jìn)一步去除雜蛋白，優(yōu)化純度（純度可達(dá) 95% 以上）。
  • 濃縮與復(fù)性：通過超濾離心濃縮蛋白，若存在少量聚集物，可通過透析復(fù)性處理。

• 表達(dá)形式：多以包涵體形式存在于細(xì)菌沉淀中。
• 純化流程： 
  • 破菌：超聲或高壓均質(zhì)破碎細(xì)菌，離心收集包涵體。
  • 溶解：用 8M 尿素或 6M 鹽酸胍溶解包涵體，加入還原劑（如 DTT）破壞錯誤折疊的二硫鍵。
  • 親和純化：His-tag 標(biāo)記的 VP2 蛋白通過 Ni-NTA 柱純化，洗脫液含高濃度咪唑。
  • 復(fù)性：梯度透析去除變性劑，同時加入氧化還原對（如 GSH/GSSG）促進(jìn)二硫鍵正確折疊，復(fù)性后通過凝膠過濾層析（如 Superdex 系列）去除聚集體。

• SDS-PAGE 與 Western blot：檢測分子量及純度，重組 VP2 蛋白在凝膠中呈現(xiàn)單一清晰條帶（真核表達(dá)約 55 kDa，原核表達(dá)約 47 kDa）。
• ELISA 與中和試驗：驗證抗原活性，重組 VP2 蛋白需能特異性結(jié)合 IBDV 陽性血清，并誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生。

重組 VP2 蛋白的結(jié)構(gòu)與分子量直接影響其抗原活性，而純化方式的選擇需結(jié)合表達(dá)系統(tǒng)特性（真核 / 原核）與應(yīng)用場景（診斷 / 疫苗）。真核表達(dá)系統(tǒng)（如桿狀病毒）因糖基化修飾完整、可溶性高，成為疫苗用重組 VP2 蛋白的首選；原核表達(dá)則需通過復(fù)雜復(fù)性工藝恢復(fù)活性，更適合科研或低成本診斷抗原制備。純化后的重組 VP2 蛋白需通過多維度驗證，確保其結(jié)構(gòu)完整性與免疫原性，為 IBD 防控提供有效工具。