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PCR凝膠電泳過(guò)程中雜帶的成因和可能的解決方案

瀏覽次數(shù):32 發(fā)布日期:2025-7-11  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

 
PCR出現(xiàn)雜帶的處理辦法]

 
PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和凝膠電泳是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù),它們通常結(jié)合使用以鑒定和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。然而,在進(jìn)行PCR凝膠電泳時(shí),經(jīng)常會(huì)在電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)雜帶,這些雜帶可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

本文將探討PCR凝膠電泳過(guò)程中雜帶的成因,并提供一些可能的解決方案。


PCR條件優(yōu)化: 調(diào)整PCR反應(yīng)條件,退火溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致引物與模板的非特異性結(jié)合,從而引發(fā)非特異性擴(kuò)增;退火溫度過(guò)高則可能抑制引物與模板的正常結(jié)合,影響擴(kuò)增效率。可以通過(guò)梯度PCR實(shí)驗(yàn)逐步確定最佳的退火溫度 一般而言,PCR反應(yīng)的退火步驟的溫度通常在50°C到68°C之間,具體取決于引物的堿基序列和目標(biāo)DNA的特性。有些引物需要更高的退火溫度來(lái)確保特定區(qū)域的特異性結(jié)合,但一般情況下,最高退火溫度不會(huì)超過(guò)68°C。

 
引物設(shè)計(jì)不合理:如果引物長(zhǎng)度過(guò)短、序列重復(fù)或含有高GC區(qū)域,可能導(dǎo)致引物與模板的非特異性結(jié)合,進(jìn)而產(chǎn)生雜帶。需要重新設(shè)計(jì)引物,確保引物的長(zhǎng)度適當(dāng)、序列不重復(fù)、GC含量適中,并避免在引物內(nèi)部或引物與模板的結(jié)合區(qū)域出現(xiàn)高GC區(qū)域。


引物用量不當(dāng):引物用量過(guò)大或特異性不高,可能會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,從而產(chǎn)生雜帶。建議調(diào)換引物或降低引物的使用量。

模板不純:模板DNA中含有雜質(zhì),如蛋白質(zhì)、RNA或其他非目標(biāo)DNA片段,可能作為PCR擴(kuò)增的模板,導(dǎo)致額外條帶的出現(xiàn)。

模板降解:模板DNA在提取或儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生降解,產(chǎn)生的小片段DNA可能成為非特異性擴(kuò)增的模板。

純化模板DNA:PCR實(shí)驗(yàn)中的模板DNA可以來(lái)自多種來(lái)源,包括基因組DNA(gDNA)、互補(bǔ)DNA(cDNA)以及質(zhì)粒DNA等。然而,不同來(lái)源的DNA在組成和復(fù)雜度上可能有所不同,這會(huì)影響PCR擴(kuò)增的最佳起始量。例如,在50 μL的PCR反應(yīng)中,質(zhì)粒DNA僅需0.1–1 ng,而gDNA則需要5–50 ng。此外,所使用的DNA聚合酶類型也會(huì)對(duì)最佳模板起始量產(chǎn)生影響。經(jīng)過(guò)改造的DNA聚合酶對(duì)模板的親和力更強(qiáng),靈敏度更高,因此所需的DNA起始量相對(duì)較少。優(yōu)化DNA起始量至關(guān)重要,因?yàn)槠鹗剂窟^(guò)高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)增加,而起始量過(guò)低則可能降低PCR的得率。有時(shí),PCR實(shí)驗(yàn)方案會(huì)使用拷貝數(shù)來(lái)表示DNA起始量,特別是對(duì)于gDNA。拷貝數(shù)的計(jì)算涉及Avogadro常數(shù)和摩爾質(zhì)量,具體公式為:拷貝數(shù) = L × 摩爾數(shù) = L ×(總質(zhì)量/摩爾質(zhì)量)。

Mg2 濃度過(guò)高:Mg2 是PCR反應(yīng)中的重要成分,但其濃度過(guò)高會(huì)降低PCR擴(kuò)增的特異性,增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)。需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳的Mg2 濃度。

酶的用量或質(zhì)量不佳:酶的用量過(guò)高或酶的質(zhì)量不好,都會(huì)影響PCR反應(yīng)。建議降低酶量或更換另一來(lái)源的酶。

使用熱啟動(dòng)PCR: 熱啟動(dòng)PCR可以減少反應(yīng)在低溫度時(shí)可能引起的非特異性擴(kuò)增。

熱啟動(dòng)PCR是一種用于減少非特異性擴(kuò)增的技術(shù)。在常規(guī)PCR中,當(dāng)反應(yīng)溫度升高到擴(kuò)增溫度之前,引物可能已經(jīng)結(jié)合到模板DNA上。這可能導(dǎo)致在PCR開(kāi)始階段就發(fā)生非特異性擴(kuò)增,產(chǎn)生雜帶或假陽(yáng)性結(jié)果。熱啟動(dòng)PCR通過(guò)在PCR反應(yīng)中添加熱穩(wěn)定的DNA聚合酶來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。

熱啟動(dòng)PCR的關(guān)鍵是使用一種需要高溫激活的聚合酶。這樣的酶在較高溫度下才會(huì)變活躍,因此在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)才會(huì)開(kāi)始擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列,而不會(huì)在低溫時(shí)引發(fā)非特異性反應(yīng)。

一些常用的熱啟動(dòng)聚合酶包括熱穩(wěn)定的Taq聚合酶的改良版本,例如具有熱活化域的Taq DNA聚合酶,以及Pfu或Phusion等高保真度聚合酶。

所以現(xiàn)在的酶基本上都滿足條件。


檢查實(shí)驗(yàn)室環(huán)境: 避免DNA污染及實(shí)驗(yàn)儀器的污染,使用無(wú)菌技術(shù)和經(jīng)過(guò)處理的試劑,保持實(shí)驗(yàn)室清潔。

 
梯度優(yōu)化PCR:
使用溫度梯度進(jìn)行PCR反應(yīng),尋找最適合特異性擴(kuò)增的溫度。


智能二維梯度PCR儀可在在同一反應(yīng)中同時(shí)優(yōu)化變性及退火的溫度梯度變性可設(shè)橫向8行變性梯度縱向可設(shè)12列退火溫度,從而來(lái)優(yōu)化最佳的退火溫度,從而提高PCR反應(yīng)的特異性和效率。

 
這個(gè)技術(shù)對(duì)于優(yōu)化引物、模板和PCR條件非常有用,以確保獲得高質(zhì)量和特異性的PCR產(chǎn)物。

這些方法可以單獨(dú)或結(jié)合使用,幫助減少或消除PCR雜帶問(wèn)題。

發(fā)布者:杭州柏恒科技有限公司
聯(lián)系電話:0571-88992477
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