[ PCR出現雜帶的處理辦法]

 
PCR（聚合酶鏈式反應）和凝膠電泳是分子生物學研究中常用的技術，它們通常結合使用以鑒定和分析PCR擴增產物。然而，在進行PCR凝膠電泳時，經常會在電泳圖譜中發現雜帶，這些雜帶可能會干擾實驗結果，甚至導致實驗失敗。

本文將探討PCR凝膠電泳過程中雜帶的成因，并提供一些可能的解決方案。

PCR條件優化： 調整PCR反應條件，退火溫度過低會導致引物與模板的非特異性結合，從而引發非特異性擴增；退火溫度過高則可能抑制引物與模板的正常結合，影響擴增效率。可以通過梯度PCR實驗逐步確定最佳的退火溫度 一般而言，PCR反應的退火步驟的溫度通常在50°C到68°C之間，具體取決于引物的堿基序列和目標DNA的特性。有些引物需要更高的退火溫度來確保特定區域的特異性結合，但一般情況下，最高退火溫度不會超過68°C。

 
引物設計不合理：如果引物長度過短、序列重復或含有高GC區域，可能導致引物與模板的非特異性結合，進而產生雜帶。需要重新設計引物，確保引物的長度適當、序列不重復、GC含量適中，并避免在引物內部或引物與模板的結合區域出現高GC區域。

引物用量不當：引物用量過大或特異性不高，可能會導致非特異性擴增，從而產生雜帶。建議調換引物或降低引物的使用量。

模板不純：模板DNA中含有雜質，如蛋白質、RNA或其他非目標DNA片段，可能作為PCR擴增的模板，導致額外條帶的出現。

模板降解：模板DNA在提取或儲存過程中發生降解，產生的小片段DNA可能成為非特異性擴增的模板。

純化模板DNA：PCR實驗中的模板DNA可以來自多種來源，包括基因組DNA（gDNA）、互補DNA（cDNA）以及質粒DNA等。然而，不同來源的DNA在組成和復雜度上可能有所不同，這會影響PCR擴增的最佳起始量。例如，在50 μL的PCR反應中，質粒DNA僅需0.1–1 ng，而gDNA則需要5–50 ng。此外，所使用的DNA聚合酶類型也會對最佳模板起始量產生影響。經過改造的DNA聚合酶對模板的親和力更強，靈敏度更高，因此所需的DNA起始量相對較少。優化DNA起始量至關重要，因為起始量過高可能導致非特異性擴增的風險增加，而起始量過低則可能降低PCR的得率。有時，PCR實驗方案會使用拷貝數來表示DNA起始量，特別是對于gDNA。拷貝數的計算涉及Avogadro常數和摩爾質量，具體公式為：拷貝數 = L × 摩爾數 = L ×（總質量/摩爾質量）。

Mg2 濃度過高：Mg2 是PCR反應中的重要成分，但其濃度過高會降低PCR擴增的特異性，增加非特異性擴增的風險。需要通過實驗確定最佳的Mg2 濃度。

酶的用量或質量不佳：酶的用量過高或酶的質量不好，都會影響PCR反應。建議降低酶量或更換另一來源的酶。

使用熱啟動PCR： 熱啟動PCR可以減少反應在低溫度時可能引起的非特異性擴增。

熱啟動PCR是一種用于減少非特異性擴增的技術。在常規PCR中，當反應溫度升高到擴增溫度之前，引物可能已經結合到模板DNA上。這可能導致在PCR開始階段就發生非特異性擴增，產生雜帶或假陽性結果。熱啟動PCR通過在PCR反應中添加熱穩定的DNA聚合酶來解決這個問題。

熱啟動PCR的關鍵是使用一種需要高溫激活的聚合酶。這樣的酶在較高溫度下才會變活躍，因此在反應開始時才會開始擴增目標DNA序列，而不會在低溫時引發非特異性反應。

一些常用的熱啟動聚合酶包括熱穩定的Taq聚合酶的改良版本，例如具有熱活化域的Taq DNA聚合酶，以及Pfu或Phusion等高保真度聚合酶。

所以現在的酶基本上都滿足條件。

檢查實驗室環境： 避免DNA污染及實驗儀器的污染，使用無菌技術和經過處理的試劑，保持實驗室清潔。

 
梯度優化PCR：使用溫度梯度進行PCR反應，尋找最適合特異性擴增的溫度。

智能二維梯度PCR儀可在在同一反應中同時優化變性及退火的溫度梯度變性可設橫向8行變性梯度縱向可設12列退火溫度，從而來優化最佳的退火溫度，從而提高PCR反應的特異性和效率。

 
這個技術對于優化引物、模板和PCR條件非常有用，以確保獲得高質量和特異性的PCR產物。

這些方法可以單獨或結合使用，幫助減少或消除PCR雜帶問題。