一、犬松弛素（CHW）概述

犬松弛素（Canine Relaxin，CHW）是由犬卵巢、胎盤等組織分泌的肽類激素，屬于胰島素超家族。其主要功能包括：

• 妊娠期松弛骨盆韌帶、軟化子宮頸，促進(jìn)分娩；
• 參與心血管調(diào)節(jié)、乳腺發(fā)育及組織修復(fù)等生理過程。
  制備 CHW 單克隆抗體對(duì)犬繁殖疾病診斷（如早產(chǎn)、流產(chǎn)檢測(cè)）、生殖內(nèi)分泌研究及相關(guān)藥物開發(fā)具有重要意義。

二、CHW 單克隆抗體制備流程
（一）抗原制備與優(yōu)化

1. CHW 蛋白獲取

   • 天然提取：從妊娠犬胎盤或卵巢組織中通過勻漿、離心提取粗蛋白，再經(jīng)層析（親和層析 / 離子交換層析）純化，但天然蛋白產(chǎn)量低、純度難以保證。
   • 重組表達(dá)： 
     • 克隆犬松弛素基因（含 A 鏈和 B 鏈編碼區(qū)），構(gòu)建至原核表達(dá)載體（如 pET 系統(tǒng)）或真核載體（如 CHO 細(xì)胞）；
     • 誘導(dǎo)表達(dá)后，通過鎳柱親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE 和 Western blot 驗(yàn)證純度（≥95%），并復(fù)性處理以確保抗原構(gòu)象正確。

2. 抗原修飾與佐劑結(jié)合

   • 由于 CHW 分子量小（約 6 kDa），需與載體蛋白（如 KLH、BSA）偶聯(lián)以增強(qiáng)免疫原性；
   • 與弗氏完全佐劑（初次免疫）或不完全佐劑（加強(qiáng)免疫）按 1:1 體積比乳化，制備免疫抗原。

（二）動(dòng)物免疫方案

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇
   6-8 周齡 SPF 級(jí) Balb/c 小鼠（n=3-5），免疫前檢測(cè)血清背景抗體（避免非特異性反應(yīng)）。

2. 免疫程序

   • 初次免疫：背部皮下多點(diǎn)注射偶聯(lián)抗原（50-100 μg / 只）+ 弗氏完全佐劑；
   • 加強(qiáng)免疫：每 2-3 周注射一次，共 3-4 次，使用弗氏不完全佐劑，劑量同初次；
   • 末次免疫：融合前 3 天，腹腔注射無佐劑抗原（50 μg / 只），刺激 B 細(xì)胞活化。

3. 免疫效果監(jiān)測(cè)
   末次免疫后 7 天，采集小鼠血清，用 ELISA 法檢測(cè)抗 CHW 抗體效價(jià)，選擇效價(jià)≥1:10,000 的小鼠進(jìn)行脾細(xì)胞提取。

（三）雜交瘤細(xì)胞制備與篩選

1. 脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合

   • 取免疫小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液（約 1×10^8 個(gè)細(xì)胞），與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞（脾細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞 = 5:1）在 50% PEG（分子量 1500）作用下，37℃融合 1.5 分鐘，隨后用 HAT 培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

2. HAT 培養(yǎng)基篩選
   接種融合細(xì)胞于 96 孔板（2×10^5 細(xì)胞 / 孔），培養(yǎng) 4-5 天后，未融合細(xì)胞死亡，僅雜交瘤細(xì)胞存活（需每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換 1/2 培養(yǎng)基）。

3. 陽性克隆篩選與克隆化

   • ELISA 初篩：以重組 CHW 蛋白包被 96 孔板（1 μg/mL），加入培養(yǎng)上清，篩選 OD 值≥陰性對(duì)照 2.1 倍的孔；
   • 有限稀釋法克隆化：將陽性孔細(xì)胞按 0.5 個(gè) / 孔接種至 96 孔板，重復(fù) 3 次克隆化，直至獲得單克隆細(xì)胞株（確保單克隆抗體特異性）。

（四）單克隆抗體生產(chǎn)與純化

1. 腹水制備（大量生產(chǎn)）

   • 給 Balb/c 小鼠腹腔注射石蠟油（0.5 mL / 只）預(yù)處理，7 天后接種雜交瘤細(xì)胞（1×10^6 個(gè) / 只）；
   • 7-10 天后收集腹水，4℃離心（3000 rpm，10 分鐘），上清經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)（小規(guī)模生產(chǎn)）

   • 雜交瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基（如 SFM4CHO）中懸浮培養(yǎng)，收集上清（抗體濃度約 50-200 μg/mL）。

3. 抗體純化

   • 腹水純化：先用 50% 硫酸銨沉淀去除雜蛋白，再通過 Protein G 親和層析（針對(duì) IgG 類抗體）或離子交換層析進(jìn)一步純化，PBS 透析脫鹽；
   • 上清純化：直接經(jīng)親和層析或超濾（10 kDa 截留分子量）濃縮，SDS-PAGE 驗(yàn)證純度。

（五）抗體鑒定與質(zhì)量控制

1. 效價(jià)測(cè)定

   • ELISA 法檢測(cè)腹水抗體效價(jià)（應(yīng)≥1:10^5），上清效價(jià)≥1:10^3。

2. 特異性驗(yàn)證

   • Western blot：檢測(cè)抗體與天然 CHW 或重組 CHW 的結(jié)合特異性，同時(shí)驗(yàn)證是否與犬其他激素（如胰島素、IGF）交叉反應(yīng)；
   • 免疫組化：對(duì)妊娠犬胎盤組織切片進(jìn)行染色，確認(rèn)抗體對(duì) CHW 的定位特異性（如滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)）。

3. 亞型與親和力測(cè)定

   • 用小鼠單克隆抗體亞型試劑盒確定 Ig 亞型（如 IgG1、IgM）；
   • 表面等離子共振（SPR）或 ELISA 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗體與 CHW 的親和力（KD 值≤10^-8 M 為高親和力）。

三、關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)與解決方案 四、應(yīng)用場(chǎng)景

1. 臨床診斷

   • 制備犬妊娠檢測(cè)試紙條（檢測(cè)血清 / 尿液中 CHW 水平），用于早期妊娠診斷或流產(chǎn)預(yù)警；
   • 開發(fā) ELISA 試劑盒，輔助診斷犬子宮蓄膿、卵巢功能異常等繁殖疾病。

2. 基礎(chǔ)研究

   • 免疫熒光定位 CHW 在犬生殖器官中的表達(dá)分布；
   • 免疫沉淀（IP）結(jié)合質(zhì)譜分析 CHW 互作蛋白，研究其信號(hào)通路。

3. 藥物研發(fā)

   • 作為工具抗體篩選 CHW 受體拮抗劑，用于治療犬早產(chǎn)或異常妊娠；
   • 抗體偶聯(lián)藥物（ADC）研究（實(shí)驗(yàn)階段），靶向遞送藥物至 CHW 高表達(dá)組織。

五、注意事項(xiàng)

1. 抗原構(gòu)象：CHW 含二硫鍵，重組表達(dá)時(shí)需確保正確折疊，否則可能影響抗體識(shí)別表位；
2. 動(dòng)物倫理：免疫實(shí)驗(yàn)需符合 AAALAC 或當(dāng)?shù)貏?dòng)物保護(hù)法規(guī)，使用鎮(zhèn)痛劑減少動(dòng)物應(yīng)激；
3. 保存條件：純化抗體分裝后 - 20℃保存（避免反復(fù)凍融），加入 0.02% 疊氮鈉防止污染；
4. 應(yīng)用優(yōu)化：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄈ缭\斷或研究）調(diào)整抗體工作濃度，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。

通過上述流程制備的犬松弛素單克隆抗體，可滿足從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的多場(chǎng)景需求，其核心在于抗原設(shè)計(jì)的合理性、雜交瘤篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性及抗體功能的系統(tǒng)性驗(yàn)證。