糖基化修飾是蛋白質(zhì)中最普遍的翻譯后修飾，在調(diào)節(jié)生理和病理過程中發(fā)揮著非常重要的作用。近年來，基于質(zhì)譜的定量糖蛋白組學闡明了糖基化修飾/糖蛋白在生理和病理過程中的作用，并逐漸成為一種篩選潛在生物標志物的重要方法。然而由于復雜樣品中糖肽的濃度比較低、糖鏈組成非常復雜等原因，對于完整N-糖肽的定性定量分析仍然存在著一定的難度。肝臟疾病是困擾我國人群的主要疾病之一，亟需篩選生物標志物用于早期的臨床檢測和診斷。

2022年4月，復旦大學生物醫(yī)學研究院陸豪杰教授團隊在National Science Review（IF 17.275）發(fā)表了一篇題為“High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis”的研究文章，該文中提出了一種高通量完整N-糖肽定量的研究方法（HTiGQs），并利用完整N-糖肽方法分析篩選了不同肝臟疾病的生物標志物、采用PRM的方式驗證了肝臟疾病不同階段的糖基化表達的變化。
研究材料：
肝臟疾病患者和健康對照的血清

技術路線：
步驟1：HTiGQs增強了完整N-糖肽的鑒定和定量；
步驟2：大規(guī)模血清糖蛋白組學的表征；
步驟3：肝臟疾病生物標志物的篩選。

研究結果：

1. HTiGQs增強了完整N-糖肽的鑒定
作者的研究路線如圖1所示，首先利用10-plex TMT進行糖肽標記，隨后在HCD和ETD-MS/MS模式下，加入DMEN進一步標記N-糖肽。待驗證標記成功后，作者比較了有標記和沒有標記的N-糖肽的鑒定結果，研究發(fā)現(xiàn)標記后鑒定到的N-糖肽數(shù)量是未標記的三倍（圖2a）且肽譜匹配得分更可靠(圖2b), ETD-MSMS的鑒定數(shù)量較HC模式下更多（圖2c）,且DMEN標記顯著增加了糖肽的電荷數(shù)（圖2d-2e），進而提高了ETD-MS/MS模式下對完整N-糖肽檢測的可靠度（圖2f）。   雖然TMT標記提高了單個實驗的通量，但結果發(fā)現(xiàn)TMT標記后的糖肽的報告離子強度較低，因此為了平衡報告離子強度和識別的糖肽數(shù)量之間的關系，作者研究了不同HCD碰撞能和ETD觸發(fā)獲取方法的組合（圖3a），結果發(fā)現(xiàn)sceHCD-pd-ETD 50±10的方法對于完整N-糖肽的鑒定和定量是最優(yōu)的采集方法（圖3b-3c）。作者進一步用IgG標品驗證HTiGQs的動態(tài)范圍和準確度，結果證實了HTiGQs對于完整N-糖肽定量的準確性（圖3d-3f）。  
3. 大規(guī)模血清糖蛋白組學的表征
為了測試HTiGQs對復雜生物樣本糖基化分析的適用性，作者使用HTiGQs方法對人血清中的糖蛋白組進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)與非標記完整N-糖肽相比，標記后完整N-糖肽的數(shù)量增加了75%以上(圖4a)。使用HTiGQs方法鑒定到N-糖基化修飾位點的motif分析結果與已知的N糖基化位點序列一致（N-X-S/T）(圖4c)。隨后作者對鑒定到的N糖基化蛋白進行了GO富集分析（圖4d）、糖型分析（圖4e）、糖蛋白-糖鏈網(wǎng)絡圖（圖4f）、糖鏈共現(xiàn)網(wǎng)絡圖（圖4g）,結果表明：巖藻糖化和唾液酸化是血清中最常見的糖基化類型、血清糖蛋白高度復雜的異質(zhì)性（多個蛋白含有5個或更多的糖基化位點）、巖藻糖化的聚糖經(jīng)常同時發(fā)生且它們還與其他幾個復雜的和唾液酸化的聚糖群同時發(fā)生。綜上所述，HTiGQs能夠在復雜的生物樣本(如血清)中大規(guī)模表征完整N-糖肽。
4. 肝臟疾病生物標志物的篩選
已知免疫球蛋白IgG的N-糖基化與疾病的發(fā)病機制和進展密切有關。本研究中作者分析了90例不同嚴重程度的人類肝病患者（慢性HBV感染、CIR（肝硬化）和HCC（肝細胞癌））和健康對照（HC）的血清中IgG 完整N-糖肽的變化，確定與某些肝臟疾病相關的特異性糖肽生物標志物。

此次研究總共鑒定到313個IgG完整N-糖肽。通過顯著差異比較分析篩選后，作者選擇27個顯著差異糖肽（圖5d）作為生物標志物的分析。研究發(fā)現(xiàn)糖肽IgG1-H3N5F1和IgG1-H3N4F1可以將HCC組和HC組區(qū)分開來，IgG2-H6N3F1可用于區(qū)分HBV和CIR（圖5f）。多個糖肽的聯(lián)合：IgG1-H3N5F1和IgG4-H4N3可以有效區(qū)分HBV、CIR和HCC組和HC組（圖5g）。

隨后，作者在34例肝病血清和11例健康對照中使用PRM方法驗證了肝臟疾病不同階段之間的糖基化表達變化。結果表明IgG1-H3N5F1可以有效區(qū)分HCC和HC組（圖6）。  
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