STR（Short Tandem Repeats，短串聯(lián)重復序列）分析已被國際細胞系鑒定協(xié)會（ICLAC：International Cell Line Authentication Committee )、ATCC、NIST（美國國家標準局）等權(quán)威機構(gòu)作為金標準應用于細胞鑒定。目前使用錯誤細胞情況非常嚴重，據(jù)統(tǒng)計約30%細胞系被交叉污染或錯誤辨識，因使用了交叉污染或錯誤辨識的細胞而導致研究結(jié)論錯誤、結(jié)果不可重復，而且會造成大量人力、物力、金錢損失。Nature和Science等越來越多的雜志要求在投稿時提供細胞STR鑒定報告。

 

小希整理了以下細胞STR鑒定相關各類問題大合集，為您解決細胞鑒定中的“疑難雜癥”。

 

 

Q:什么是細胞STR鑒定？

A: STR即短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats），也稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），通常是基因組中由1~6個堿基單元組成的一段DNA重復序列，由于核心單位重復數(shù)目在個體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，構(gòu)成了STR基因座的遺傳多態(tài)性。細胞STR鑒定即通過STR信息建立細胞系的遺傳特性，通過STR鑒定來檢測細胞是否發(fā)生交叉污染現(xiàn)象。

 

STR圖譜

Q:為什么要進行細胞STR鑒定？

A: 由于細胞系發(fā)生交叉污染或身份誤認，可以導致實驗數(shù)據(jù)的無效和數(shù)據(jù)的誤導。NIH已發(fā)出公告，討論細胞系鑒定的必要性， ATCC數(shù)據(jù)庫要求研究者對細胞系進行鑒定，Nature和Science等越來越多的期刊也要求文章發(fā)表前需提供細胞鑒定材料。

Q:如何進行細胞STR鑒定？

A: 細胞STR鑒定目前主要基于多重PCR結(jié)合熒光探針檢測技術，對人源多個STR位點進行檢測。Dr.Cell實驗室對人源細胞21個基因座進行檢測，所選用的基因座不僅包含ATCC、DSMZ和JCRB細胞庫中的9個基因座，更添加12個高度多態(tài)性位點，可方便與權(quán)威數(shù)據(jù)庫進行比對，具有極高的準確性。

Q:什么時候需做細胞STR鑒定？

A:

●  當實驗室引入新的細胞系

●  細胞來源于組織——原代細胞

●  文章發(fā)表，國外期刊雜志要求

●  細胞功能不正常

●  細胞系表現(xiàn)不穩(wěn)定或結(jié)果與預期差別較大

●  細胞已連續(xù)培養(yǎng)6個月時，實驗室細胞常規(guī)定期鑒定

●  當實驗室使用超過一種細胞系時，所有細胞系最好先鑒定以排除交叉污染的可能

Q:如何提供STR檢測樣本？

A:

●  提供細胞樣本：培養(yǎng)后的細胞進行離心，去掉上清培養(yǎng)液，將細胞沉淀冰袋運輸，細胞數(shù)量大于10^6。

●  提供基因組DNA: ≥20μL，濃度≥50ng/μL。

Q:細胞STR檢測流程？

A: 提取細胞基因組DNA，然后進行PCR擴增及測序，最后進行結(jié)果分析。詳細檢測流程請看下圖：

 

Q:如何判斷細胞系是否發(fā)生交叉污染？

A: 如果存在細胞系之間發(fā)生交叉污染，那么在STR圖譜上多個位點會出現(xiàn)兩個以上的峰。峰高值表示該等位基因的信號強度，理論上峰值與樣本的DNA濃度有直接的關系。因此，存在交叉污染的混合細胞系中，其中一個位點中某些峰會明顯高于其他的峰，其中大峰是屬于混合細胞系中那個主要細胞系，而小峰則屬于那個次要細胞系。

 

發(fā)生細胞交叉污染現(xiàn)象，基因組出現(xiàn)多等位基因

Q:如何查看細胞STR鑒定報告？

A: 查閱文章：STR鑒定報告看不懂？希爾博士來解憂 

Q:如果細胞樣本STR檢測數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中對比結(jié)果為匹配＜100%？

A:人源細胞STR鑒定結(jié)果判定標準：

受檢細胞STR位點的基因分型數(shù)據(jù)與其對應的標準細胞系（其原始組織或衍生細胞系）STR基因分型數(shù)據(jù)進行比對：

1）若兩者的匹配度≥80%，則判定受檢細胞系為標準細胞系或為標準細胞系的衍生細胞系。

2）若兩者的匹配度在50%-79%之間，建議結(jié)合細胞系形態(tài)、細胞系特異性標記物等輔助分析進行綜合判斷。

3）若兩者的匹配度<50%，則判定受檢細胞樣本與其對應的標準細胞系不相關。

Q:有哪些細胞STR數(shù)據(jù)庫？

A: 

• CLIMA 數(shù)據(jù)庫-Cell Line Integrated Molecular Authentication (CLIMA)

• ATCC數(shù)據(jù)庫-American Type Culture Collection (ATCC）

• DSMZ 數(shù)據(jù)庫-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)

• Expasy 數(shù)據(jù)庫- SIB Swiss Institute of Bioinformatics (Expasy)

• NCBI 數(shù)據(jù)庫-NCBI BioSample

• NICR 數(shù)據(jù)庫-國家實驗細胞資源共享服務平臺

 

Dr.Cell實驗室應用DSMZ數(shù)據(jù)庫進行細胞STR數(shù)據(jù)比對，DSMZ數(shù)據(jù)庫包含來自于ATCC，DSMZ，JCRB和RIKEN數(shù)據(jù)庫的2000多個細胞系STR數(shù)據(jù)。

Q:如果細胞系在數(shù)據(jù)庫中沒有STR數(shù)據(jù)？

A:若樣本為原代細胞，或者樣本在已知數(shù)據(jù)庫中沒有STR數(shù)據(jù)信息，可以用自己的細胞遺傳信息建立自己的遺傳數(shù)據(jù)，以便后期進行自己細胞庫的比對。

Q:細胞系交叉污染或錯誤鑒定對研究是否有影響？

A:答案是肯定的。使用錯誤的細胞系或者是被污染的細胞系做研究，造成時間，金錢和精力的損失，實驗結(jié)果的不一致和不可重復。因此用被污染或錯誤的細胞系做研究，在發(fā)表文章或做進一步研究時極有可能需要用正確的細胞再重復實驗。

 

2015年Science上發(fā)表的一篇文章，統(tǒng)計了兩株存在嚴重污染的細胞系HEp-2和INT 407（實際上都是HeLa），HEp-2發(fā)表了近6000篇SCI文章，INT 407也發(fā)表了1300 多篇SCI文章，據(jù)估算，這兩種污染對初始研究總共造成的經(jīng)濟損失達到7億美元，而對后續(xù)的跟蹤研究造成的經(jīng)濟損失達到35億美元。

 

Q:有哪些細胞污染源？

A:ICLAC數(shù)據(jù)庫中有列出154個不同的污染源，其中HeLa細胞是最大的污染源（129個細胞系被證實HeLa污染），依次是T-24(21個細胞系被證實T-24污染) 和 M14 (18個細胞系被證實M14污染)。

 

Dr.Cell 實驗室鑒定的細胞STR結(jié)果，其中HeLa細胞也是最大的污染源，其次是A375、COLO201(如下圖)。

 

細胞污染來源    

Q:是否可以鑒定非人源細胞？

A:除人源細胞外，可以鑒定小鼠來源細胞。

 

小鼠細胞STR鑒定--依據(jù)美國國家標準技術研究所NIST和ATCC建議，檢測小鼠細胞：4-2、5-5、6-4、6-7、9-2、12-1、15-3、18-3、X-1，9個基因位點。另外添加人源位點D4S2408，用于鑒定人鼠細胞交叉污染。

 

由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫僅公布少量的小鼠細胞STR圖譜數(shù)據(jù)，故小鼠細胞STR鑒定僅對細胞系進行檢測，出具STR圖譜，不進行小鼠細胞品系鑒定。

 

 

對于人源、小鼠之外其他物種細胞，Dr.Cell實驗室可以提供細胞物種鑒定，檢測人(Human，學名：Homo sapiens) 、小鼠(Mouse，學名：Mus musculus，mouse)、大鼠(Rat，學名：Rattus norvegicus)、中國倉鼠(Chinese Hamster，學名：Cricetulus griseus)、獼猴(Rhesus Monkey，學名：Macaca mulatta)、豬(Pig，學名：Sus scrofa) 、牛(Bovine，學名：Bos primigenius taurus)、狗(Dog，學名：Canis lupus familiaris)、貓(Cat，學名：Felis silvestris catus)、馬(Horse，學名：Equus ferus caballus)、兔(Rabbit，學名：Oryctolagus cuniculus)、雞(Chicken，學名：Gallus gallus)、果蠅(Fruit Fly，學名：Drosophila melanogaster)、斑馬魚(Zebra Fish，學名：Danio rerio)、非洲綠猴(Green Monkey，學名：Cercopithecus aethiops )15個種屬來源的細胞，判斷樣本是否存在這15個種屬間的交叉污染。

Q:提供的STR報告是否可以用于文章發(fā)表？

A: Dr.Cell實驗室提供中英文雙語檢測報告，可以直接提交國內(nèi)外雜志期刊，發(fā)表文章應用。引用文章信息可查閱：Dr.Cell 技術服務發(fā)表參考文獻。

 

報告樣式（部分）

參考文獻

• Capes-Davis A , et al. Match criteria for human cell line authentication: where do we draw the line. Int J Cancer. 2013;132(11):2510-2519.

• Neimark J. Line of attack. Science. 2015;347(6225):938-940.