變形鏈球菌能有效地利用食物中的蔗糖產(chǎn)生胞外多糖，而胞外多糖主要是通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶(Gtfs)的作用合成的。本研究對(duì)變形鏈球菌的乙酰化修飾蛋白進(jìn)行了鑒定，并對(duì)變形鏈球菌生物膜生長(zhǎng)(SMB)和浮游生物膜生長(zhǎng)(SMP)的乙酰化修飾蛋白進(jìn)行了定量分析，采用TMT標(biāo)記和Kac親和富集結(jié)合高分辨率質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法定量蛋白質(zhì)乙酰化的動(dòng)態(tài)變化，共鑒定了445個(gè)蛋白中的973個(gè)乙酰化位點(diǎn)，其中定量了302個(gè)蛋白中的617個(gè)乙酰化位點(diǎn)。

總體分析表明，22.7%的蛋白質(zhì)發(fā)生了乙酰化。在SMB的定量蛋白中，有56個(gè)位點(diǎn)賴氨酸的乙酰化程度升高，52個(gè)位點(diǎn)賴氨酸的乙酰化程度降低。在變形鏈球菌的乙酰基組中，鑒定得到6個(gè)顯著富集的基元，分別為Kac****K、KacF、Kac****R、KacY、KacH、F*Kac。此外，基于KEGG途徑的富集分析表明，糖酵解/糖異生和RNA降解顯著富集。特別是在變形鏈球菌生物膜中，乙酰化賴氨酸蛋白下調(diào)最多的是葡糖基轉(zhuǎn)移酶- SI、葡糖基轉(zhuǎn)移酶- I和葡糖基轉(zhuǎn)移酶- S，這可能揭示了生物膜發(fā)育過(guò)程中葡糖基轉(zhuǎn)移酶功能調(diào)控的關(guān)閉機(jī)制。

 | 研究結(jié)果

1.對(duì)突變鏈球菌中所有已鑒定的賴氨酸乙酰化蛋白進(jìn)行綜合分析
通過(guò)LC-MS/MS檢測(cè)變形鏈球菌中發(fā)生乙酰化修飾的蛋白，共鑒定出445個(gè)蛋白中973個(gè)乙酰化位點(diǎn)，其中306個(gè)蛋白中617個(gè)乙酰化位點(diǎn)進(jìn)行了定量分析。其中有56個(gè)位點(diǎn)賴氨酸的乙酰化程度升高，52個(gè)位點(diǎn)賴氨酸的乙酰化程度降低。

2. 變形鏈球菌乙酰化蛋白的亞細(xì)胞定位和功能分布
變形鏈球菌和浮游相比，對(duì)其差異的乙酰化蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位和功能分析，其中變形鏈球菌85%的乙酰化蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中，15%分布在膜中，而浮游生物中乙酰化蛋白55%分布在細(xì)胞質(zhì)中，24%分布在細(xì)胞外空間，21%分布在膜中。根據(jù)功能分布，變形鏈球菌中17%的乙酰化蛋白參與代謝過(guò)程，17%參與細(xì)胞過(guò)程，17%參與結(jié)合，14%參與催化活性，12%參與細(xì)胞。上述結(jié)果表明，賴氨酸乙酰化蛋白在變形鏈球菌中廣泛分布，提示乙酰化修飾可能在生物膜形成中起重要的調(diào)控作用。
 

3. 在浮游和變形鏈球菌生物膜細(xì)胞中差異乙酰化蛋白的功能富集
為了研究乙酰化修飾是否改變蛋白的功能，進(jìn)行了基于GO的富集分析。在碳水化合物代謝和分解代謝，以及葡聚糖代謝過(guò)程均顯著富集在調(diào)控蛋白中。基于KEGG通路對(duì)調(diào)控蛋白(SMB vs SMP)的富集分析表明，顯著的富集是糖酵解/糖異生和RNA降解。將各乙酰化肽的SMB/SMP TMT比值轉(zhuǎn)化為z-score，根據(jù)25%、50%、75%三個(gè)不同百分位的正態(tài)分布累積密度函數(shù)設(shè)置z-score的截止值。定量結(jié)果顯示，大部分乙酰化蛋白分布在Q2(25 50%)和Q3(50 75%)分位數(shù)中。
 

4. WB 驗(yàn)證
對(duì)差異乙酰化蛋白的定量分析表明，在變形鏈球菌生物膜中，乙酰化賴氨酸蛋白下調(diào)最多的是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶-SI、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶- I和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶-S。通過(guò) WB 驗(yàn)證乙酰化修飾水平，與浮游生物生長(zhǎng)相比，變形鏈球菌生物膜中的乙酰化葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶顯著下調(diào)。

 | 研究結(jié)論

在變異鏈球菌中鑒定了445個(gè)蛋白中973個(gè)乙酰化位點(diǎn)。其中22.7%的蛋白質(zhì)發(fā)生了乙酰化，主要發(fā)生在6個(gè)顯著富集的基元上，如Kac****K、KacF、Kac****R、KacY、KacH和F*Kac。

總的來(lái)說(shuō)，在生物膜階段乙酰化蛋白的數(shù)量增加。而乙酰化/去乙酰化改變的蛋白質(zhì)主要參與糖代謝和分解代謝，以及葡聚糖的代謝過(guò)程。特別是變形鏈球菌生物膜中乙酰化水平下調(diào)最多的蛋白，如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶- SI、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶- I和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶- S，可能促進(jìn)生物膜的形成。這些糖基轉(zhuǎn)移酶可能是齲齒治療的潛在靶點(diǎn)。

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