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RNA 逆轉錄實驗注意事項

瀏覽次數:8182 發布日期:2021-8-27  來源:MedChemExpress

Tips 1:防止 RNA 模板的降解

毫無疑問,RNA 質量對 cDNA 合成結果會產生重要影響。但 RNA 脆弱,易于降解。為了保證 RNA 的完整性,我們需要小心又小心,比如在冰上操作,用 RNase-free 的槍頭和離心管,減少操作時間等。在反應體系中加入 RNase 抑制劑也能有效防止 RNA 降解。
另外,建議在進行逆轉錄前,通過瓊脂糖凝膠電泳檢查 RNA 條帶的質量。通常完整的真核 RNA 應包括 28S、18S 條帶,且 28S 條帶強度一般是 18S 的兩倍左右。

 

圖 1. 高質量 RNA

 

Tips 2:RNA 定量

除了掌握 RNA 的完整性之外,反轉錄之前還需要對 RNA 濃度進行測定。一般反轉錄試劑盒會對上樣量有要求,建議 total RNA 上樣量小于 5 μg。超過這個范圍,會使反轉錄產物產生偏好性 (表達豐度高的基因優先被反轉錄) 而造成定量結果不準確。

 

Tips 3:去除基因組 DNA 污染

殘留的基因組 DNA (gDNA) 會對熒光定量結果造成很大的干擾,為了使結果更加的真實、可重復,我們需要去除 gDNA 干擾。我們可以在引物設計時避免 gDNA 的擴增,比如將上下游引物分別設在不同的外顯子上;或者在提取 RNA 后使用 DNase I 處理以除去 gDNA。最后,我們還有終極法寶——選擇一款具有 gDNA 去除功能的逆轉錄試劑盒,一步到位去除 gDNA,省心省力 max。

 

Tips 4:選擇合適的引物

Oligo dT 引物和隨機引物都能進行逆轉錄。Oligo dT 引物只能與 mRNA 的 3’ 端 poly (A) 結合,沒有 rRNA 和 tRNA 的干擾,特異性強。但其對 RNA 的完整度和二級結構的要求較高,而且不適用于原核生物。隨機引物可以根據堿基情況結合到幾乎所有的 RNA 上,包括 mRNA、tRNA 和 rRNA。但隨機引物法逆轉錄產生的片段較小,很難得到全長轉錄本的 cDNA。

單獨選擇某一種引物,實驗可能都不完美,具體需要根據實驗目的來確定。當然我們還可以選擇全都要!MCE RT mix 含有比例優化的 Oligo (dT) 和 Random Primers,使 cDNA 合成可從 RNA 轉錄本的各個區域起始,并具有相同的逆轉錄效率,最大程度保證 qPCR 結果的真實性和可重復性。
 

圖 2. Oligo dT 引物和隨機引物

 

Tips 5:逆轉錄酶熱穩定性

逆轉錄酶在整個反轉錄體系中具有關鍵性影響。除了活性以外,逆轉錄酶的熱穩定性同樣很重要,在較高溫度下進行逆轉錄,能夠減少 RNA 的二級結構,增加逆轉錄的效率。野生型的 M-MLV 逆轉錄酶很“怕熱”,高于 37℃ 時,穩定性大幅下降。

MCE 逆轉錄試劑盒全面升級
采用熱穩定性大幅度提高的第三代逆轉錄酶,該酶可耐受高達 60℃ 的反應溫度,適合具有復雜二級結構的 RNA 模板的逆轉錄。
 
1、逆轉錄溫度 55℃,攻克復雜模板及高 GC 模板;
2、逆轉錄時間縮短至 15 min,高效逆轉錄;
3、合并 gDNA digester 與 gDNA digester buffer,使用更方便;
4、與模板的親和力增強,少量模板及低拷貝基因的逆轉錄同樣適用。

 

圖 3. 高 GC 基因表達量測定。模板 293T 細胞,RNA 投入 300 ng,反應體系 20 μL 55℃ 反應不同時間

 
 

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