文章題目：Multi-omic single-cell snapshots reveal multiple independent trajectories to drug tolerance in a melanoma cell line

發表期刊：綜合性一區期刊Nat Communications（IF=12.121）

發表時間：2020-05-11

 

1.研究背景

單細胞代謝組學/蛋白質組學能直觀反映細胞動態功能的變化，是揭示細胞響應化學和環境應激的重要途徑。在高維細胞狀態空間中確定單個細胞的軌跡，對于理解從細胞分化到藥物作用下病變細胞的表觀遺傳反應等生物學變化是一個突出的挑戰。

本文利用單細胞蛋白質組學和單細胞代謝組學技術揭示了黑色素瘤細胞早期在藥物反應和藥物耐受兩種狀態之間變化的軌跡，并發現細胞在兩種狀態之間存在兩條完全不同的途徑。該結果對于腫瘤耐藥性的研究提供了新的認識。

 

2.實驗設計



3.分析結果

 

1. BRAFi處理后黑色素瘤細胞蛋白質組學和代謝組學分析

作者對細胞樣本進行了0、1、3和5天（0為對照組，1、3、5為實驗組）的藥物治療。與對照組相比，藥物處理組中，黑色素瘤細胞轉錄因子(MITF, MART1)，代謝調節因子(HIF1α, p-AMPKα)，擴增標記(Ki67)等在單細胞水平的表達存在明顯差異（圖1 b、c）。具體來看，在藥物治療初期，葡萄糖的攝取、多數代謝調節因子、磷酸化蛋白、Ki67被抑制，這些物質的抑制反應了BRAFi對關鍵致癌信號通路的抑制作用。

圖1 早期藥物處理后M397細胞的單細胞蛋白質組學和代謝組學分析

 

2. 降維分析單細胞水平從藥物敏感狀態到耐藥狀態的路徑變化

對經過BRAFi不同時長處理的樣本，利用FLOW-MAP算法對復雜高維的單細胞數據降維處理，來可視化眾多物質在單細胞水平的變化。圖2中顯示不同時長處理的黑色素瘤細胞呈現出不同模式的聚集，且MITF、MART1、Ki67、NGFR等蛋白的表達水平在第0天和第1天/3天到第5天耐藥性上呈現出了向上和向下的分叉軌跡，也暗示從藥物敏感狀態到藥物耐受狀態存在兩條通路的可能性。

 

3. Surprisal揭示細胞時間軌跡中的不同聚集模塊

為了進一步解析藥物耐藥性的分子變化軌跡，作者利用Surprisal分析了單細胞數據集，發現了兩個主要模塊（每個模塊代表一組被檢測物質）。單細胞中模塊的影響分數表示模塊中關聯分析物質在該細胞中富集或抑制的程度（圖3 a）。文章中發現模塊1的影響分數在上下兩條路徑上都從負逐漸增加到正，并且在中間時間點有明顯的正負變化（圖3 a）。模塊2的影響分數也有同樣的變化模式，兩個聚集模塊的分隔說明在耐藥發展過程中可能存在一個生物物理屏障將上下路徑分隔開了。

圖3 可視化展示兩個主要模塊的影響分數

此外，黑色素瘤細胞表型轉錄因子MITF及其下游蛋白MART1的表達均與模塊2評分呈負相關（圖3 b），這表明兩條路徑的分岔可能與這兩種蛋白有密切關系。

 

4. 路徑分岔的實驗驗證

Surprisal分析預測了從藥物敏感狀態到耐受狀態存在上下兩個路徑。但是單細胞是沿著單個軌跡進行兩種狀態的轉換還是會隨機地在多個路徑之間切換？文章中實驗結果顯示，MITF-高表達細胞顯示出較高水平的Ki67和MITF豐度，并且與MITF-低表達亞群相比，有更短的擴增時間（圖4 c-f）。

圖4 surprisal分析表明MITF為調節路徑分岔的關鍵轉錄因子

為了量化藥物治療期間MITF-高表達和MITF-低表達細胞之間隨機相互轉化的頻率，作者在BRAFi治療的第5天內檢測了單細胞內的MITF活性。結果發現，MITF-高表達細胞中的MITF活性顯示出比MITF-低表達細胞更高的活性（圖5 g），沒有觀察到兩個軌跡之間進行明顯的隨機切換。

圖5 對BRAFi治療5天的細胞用單細胞延時顯微鏡分析MITF 活性

為了進一步確認在治療的第5天后，不同類群的細胞狀態，作者量化了治療第5天后上下通路之間差異表達的SLUG、MITF、MART1和PFK在內的多個被檢測物。結果顯示，SLUG、MITF、MART1和PFK在兩條路徑之間出現了明顯的差異表達（圖4 h）。此外，SLUG、MITF、MART1和PFK在MITF-低表達細胞中的表達水平顯著低于MITF-高表達細胞（圖4 i）。

 

5. 臨界點分析確定了軌跡分岔調節物質

作者對單細胞數據集的Surprisal分析結果表明，在治療的第1天到第3天中，上下通路都具有細胞狀態轉換的特征。

圖6 兩條軌跡的臨界點分析和網絡分析

為了識別上下兩條通路上的每個臨界點，作者將所有時間點的單細胞數據聚集成14個細胞類群（圖6 a）。每一個類群代表一個過渡的中間狀態，類群1、6、7、8、10、11和12位于上通路，2、3、9、13和14位于下通路。利用SANI和Ic來預測高維狀態下的臨界轉變情況，作者發現上通路中細胞類群7和細胞類群9在各自路徑中有最高SANI值（圖6 b、c）。這表明細胞類群7和細胞類群9最接近這2條路徑上的臨界點。

通過對細胞類群7和細胞類群9的臨界點進行網絡分析，發現這兩個集群的網絡具有不同的結構特征（圖6 d、e），表明這兩個細胞類群以不同的方式調節細胞群的轉變。網絡中的hub節點調節物質，可能是潛在的藥物靶點。在細胞類群7（上通路），作者發現了一些轉錄因子和代謝酶，如MITF、PFK、p-LKB、PKM2、LDH2和SLUG，在網絡中顯示出較高的連接（圖6 f）。對于細胞類群9（下通路），TNFR、N-cadherin和p-NFκB-p65在網絡中表現出高連接性（圖6 f）。另外，在細胞類群7中得分高的物質在細胞類群9中得分低，反之亦然，這表明這兩條路徑受到不同的調節。

 

6. 確定干擾兩條路徑的物質

為了檢驗兩條路徑上的改變是否由不同的調節物質驅動，作者選擇了PKM2抑制劑，NFκB抑制劑來分別干擾細胞類群7和細胞類群9，并聯合BRAFi治療分選的MITF-高表達細胞和MITF-低表達細胞亞群。結果顯示，MITF-低表達細胞亞群對BRAFi+NF-κBi組合更敏感（圖7 a），而MITF-高表達細胞亞群對BRAFi+PKM2i組合更敏感（圖7 b）。在敲除MITF基因的M398細胞系上進行相同藥物組合的檢測，結果也得到了同樣的結論（圖7 c、d）。說明，沿著不同軌跡的細胞對PKM2和NF-κB的抑制表現出不同的敏感性。

圖7 與兩條軌跡相關的細胞中藥物敏感性差異
 

考慮到這兩條軌跡的調節依賴性差異，作者進一步假設，通過同時抑制PKM2和NF-κB信號傳導來共同阻斷這兩條軌跡，可能在阻止向BRAFi耐受的轉變方面表現出相加效應。為了驗證這一假設，作者使用三種藥物組合（BRAFi+PKM2i+NF-κBi）在體外治療M397細胞5天，并將得到的細胞數與單藥（僅BRAFi）和雙藥組合（BRAFi+PKM2i和BRAFi+NF-κBi）治療5天的細胞數進行比較。與作者的預測一致，三種藥物組合明顯優于兩種藥物組合，而兩種藥物組合又優于單一療法（圖5 e）。這意味著這些藥物可能通過選擇性地阻斷BRAFi誘導的細胞狀態向藥物耐受狀態的轉變而發揮作用。這些結果表明，上下通路是獨立的，具有不同的調節物質，有各自對應的藥物可以阻斷通路。

 

4.研究結論

該研究通過單細胞蛋白質組學和代謝組學揭示了黑色素瘤細胞藥物耐藥性形成的反應軌跡，為確定有效的治療組合提供了更準確的指導。

 

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