水迷宮（Water Maze）是目前阿爾茨海默病（Alzheimer Disease, AD）研究中使用得最多的行為學實驗方法，主要用于檢測嚙齒類動物的空間記憶能力。該方法是由理查德-莫里斯（Richard Morris）于1981年發明，并在三年后對其實驗流程進行了進一步的完善，為了表示對發明者的紀念和尊重，人們把這種實驗叫做“莫里斯水迷宮（Morris Water Maze，WMW）”。

 

從80年代初被發明之后，水迷宮逐漸成為AD認知記憶實驗中的“主力”。當我們同時以阿爾茨海默癥和行為學實驗名稱進行搜索時，水迷宮的檢索所得項目要遠多于其他任何行為學實驗（圖1A）。而且水迷宮對AD行為學研究的統治地位是與日俱增的，在1995年之前，水迷宮實驗占列入統計的7種行為學文獻總數的44%（圖1B），但是到了2020年，這一比例已經增長到了54%（圖1C）。由此可見AD研究中水迷宮所處的“統治地位”。

 

圖1. 水迷宮是AD研究中最重要的行為學實驗

 

但是和許多動物行為學實驗一樣，不同的論文中該實驗無論是在器材規格，實驗流程以及數據統計方面都有很大的差異，往往令人疑惑不解，搞不清楚水迷宮實驗到底有沒有統一的標準，哪些參數是可以更改的，哪些參數是需要慎重考慮的。為了解答這些疑惑，我們計劃從設備、主要流程和統計分析三個篇章來對水迷宮進行解析，希望能讓大家對水迷宮實驗有一個大致的了解，對影響水迷宮實驗的各種因素做到心中有數。需要注意的是，為了敘述方便，這里我們所采用的流程和實驗器材規格都是針對小鼠的，雖然大鼠實驗中參數會有一定的變化，但是原理是一樣的。今天我們從設備即器材的選擇開始講。

 

水池（Tank）

水迷宮實驗的主體是一個圓形的水池，水池的內徑一般為120-130cm之間。雖然也有研究采用的是直徑100cm或者180cm規格的水池，但水池過大會造成小鼠需要探索的面積增大，學習時間過長，并且小鼠的嬌小體型不利于熱量的保存，在水中焦躁地游泳進一步加劇了熱量的消耗，過長的游泳時間不利于小鼠身心健康，甚至危及生命；另一方面，過大的水池也會造成操作困難，尤其是在引導水池中未完成任務的小鼠走上平臺的過程中，小鼠如果位于水池中間，就是考驗實驗人員手臂長度的時候了。反過來，水池過小會導致實驗難度過低，有可能不能對神經系統損傷的小鼠和正常小鼠進行有效區分，可以理解為考題太容易，學習成績差的學生和優等生都能做出來。

 

水池一般為50-60cm高，其中水深30cm，留出20-30cm的邊緣可以用來放置提示方位用的標志物（Cue）。邊緣不宜過低，因為低于10cm的話小鼠在游泳過程中可能會跳出水池，另一方面也沒有足夠的空間貼標志物。水池一般會由支架支撐起來，高度上方便實驗人員進行操作。

 

圖2. 小鼠水迷宮尺寸

 

如果有條件，水池最好有完整的溫控系統，即溫度檢測和上升降溫裝置（主要是升溫），將水溫的波動控制在最低水平。而且這種溫控系統的升溫設備需要盡量均勻分布，否則水溫不均也會影響實驗結果。

 

水迷宮房間內的給排水系統可以大大增加實驗的便利性，因此建議設置專門的房間用于水迷宮實驗，并能直接安裝向水池提供熱水的龍頭。

 

如果沒有像實驗用水浴鍋那樣有自動溫控裝置的水池的話，為了實驗的連續性，可以用蓄水量更多的水池（即高度超過60cm），更多的水能更長時間地保持水溫。不過，仍然需要溫度計進行監控，使水溫維持在20-22度之間（其實22度是最好的，但是實際上沒有自動溫控系統的話很難維持，所以在溫度低于20度之前要及時加熱）。水溫過低會導致小鼠體溫降低，身體機能下降，嚴重的可能會導致體弱小鼠死亡，從而影響實驗結果；不過如果水溫高到一定程度后，小鼠可能會因為體感溫度舒適而導致尋找平臺的動力減弱，也不利于實驗。

 

為了方便動物行為采集系統的工作以及防止小鼠看到水下的逃生平臺，一般針對白色的小鼠，水池材質是深色即可，不需要在水中添加顏料；而白色的鈦白粉則可以用于黑色或者灰色小鼠的行為實驗。值得一提的是，有研究表明水的顏色對小鼠尋找平臺沒有影響，這可能是小鼠游泳時抬頭運動或者光線折射的緣故。但保險起見，進行深色動物實驗的同時也加入白色顏料，主要是為了增加對比度，提高視頻分析系統的準確性。

 

平臺（Platform）

逃生平臺一般為直徑7-10厘米的圓形（雖然方形平臺也常有報道，但本人更推薦圓形這種沒有尖銳突出的平臺），材料上沒有特別的要求，能讓小鼠站住不要太滑就行。

 

一般我們是靠調節水位來控制平臺是否可見的，但通常如果平臺的高度可調的話，對于訓練期增加可見平臺實驗的方案而言會省力很多。如果是專業的水迷宮設備，一般會在水池底部設置定點卡位，這樣每次就能將平臺放在固定的地方了。另外還有可以遙控平臺高度的設備，更加方便實驗者使用。

 

此外，平臺的放置位置也是有講究的，不能太靠水池邊緣，因為這樣小鼠可能學會的是繞圈求生；也不能放得太靠水池中心，這樣小鼠也不需要記住方位，只需要在水池中心很小的范圍搜索一下就行了。如果非要選定一個方位，那么平臺圓心的位置設定在2/3半徑和1/2之間（即圖3中的紅色圓形和綠色圓形之間的環狀地帶）。

 

圖3. 平臺擺放位置（120cm直徑水池為例）

 

這里需要注意的是，平臺的直徑增大，會造成迷宮的難度降低，反之則難度增加，個人推薦根據預實驗的天花板效應或者地板效應確定，個人總結的標準比例是水池直徑與平臺直徑之比大概是12.65左右，即水池的面積是平臺面積的160倍。結合120cm直徑水池的規格，平臺應設置為9.5cm直徑。

 

此外，關于平臺的放置還有以下值得注意的地方，那就是如果是在隱藏平臺期，則平臺頂部與水面的距離不應該超過1cm，因為如果平臺與水面的距離過大，小鼠還是有大半身軀浸泡在水中，因此可能會離開平臺去尋找更干燥的環境，不利于對平臺的記憶；另外如果是在可見平臺期，平臺可以放在水面以上1cm左右，太低了可能不利于小鼠觀察，太高則小鼠爬上平臺會變得困難，如果希望能加快訓練速度，還可以在平臺上放上小旗子便于小鼠觀察；檢測期如果是進行多次的話，需要讓小鼠在每個trail的最后能夠抵達平臺，但又不能小鼠還在水中游泳，實驗人員當面就把平臺放進去，所以只有自動化的水迷宮系統可以實現。

 

標志物（Cue）

標志物是動物進行空間定位的關鍵，所以相互之間的區分尤為重要。這些標志物可以放置在迷宮之外，也可以在迷宮之內，目的是讓小鼠游泳時能看到。水迷宮內部的標志物一般直徑15cm左右，而外部標志物則沒有大小的限制。標志物的數量一般在三個或者三個以上，相互之間形狀區分要顯著。

 

此外標志物在水池內部只需要10cm直徑或者邊長即可，而在外圍的話則需要相應增大。此外小鼠對顏色并不敏感，對比強烈的形狀，小鼠的區分能力更好，PS4手柄右側的○□△×就是很好區分的形狀，增加實心和空心的區別能大大增加小鼠對這些形狀的辨識度。

 

這些標志物的方位與象限對應起來，一般情況下我會以東南西北四個方位的簡稱（E, S, W, N）對四個方位進行命名，標志物也掛在或者貼在方向相應的位置，從此不再變動（當然有的實驗設計非常嚴謹，會通過改變Cue的方位來確定動物是利用它們來定位的，而非其他如氣味等方法），不過這里的名稱僅僅是用于區分而已，并不需要與真實的方向相對應。

 

圖4 標志物的放置方式[1-4]

 

視頻采集系統和行為學分析系統

視頻采集系統的搭建需要根據具體的實驗環境設置，需要注意的主要是反光和邊緣畸變。反光的問題可以通過增加光源或者調整攝像頭角度實現，邊緣畸變則需要擴大拍攝范圍，盡量使迷宮不處于邊緣。

 

好了，關于水迷宮的設備就介紹到這里，下篇文章我們將介紹水迷宮最典型的流程。賽業可為您提供用于阿爾茨海默癥研究的基因編輯鼠，如有需要，歡迎聯系我們，祝大家實驗順利~

 

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部分參考文獻及圖片來源：

[1]https://nathanshock.barshop.uthscsa.edu/integrated-physiology-aging-core/brainhealth/

[2]https://physiologicalresearch.weebly.com/water-maze-test.html

[3]https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/spatial-memory

[4]https://neuropheno.douglas.mcgill.ca/room-equipment-reservation