簡介
細(xì)胞活 / 死測定被廣泛應(yīng)用于各種研究領(lǐng)域，包括各種化合物的細(xì)胞毒性作用、實驗處理或基因表達(dá)變化的研究。自動細(xì)胞成像和分析系統(tǒng)提供了一種評價細(xì)胞活性和細(xì)胞死亡的最佳方法。在本篇應(yīng)用文獻(xiàn)中，我們介紹了使用 ImageXpress®Pico 自動細(xì)胞成像系統(tǒng)以及 CellReporterXpress 自動圖像采集和分析軟件對 EarlyToxTM Live/Dead 檢測試劑處理的細(xì)胞進(jìn)行成像。EarlyTox Live/Dead 檢測試劑盒包含了針對哺乳動物活細(xì)胞和死細(xì)胞的標(biāo)記物。活細(xì)胞可被在細(xì)胞質(zhì)中能夠發(fā)出強烈綠色熒光的Calcein AM 染色。不發(fā)熒光的 Calcein AM 可穿透完整細(xì)胞膜且其乙酰羥甲基酯 (AM) 基團(tuán)可被細(xì)胞內(nèi)的脂酶裂解，得到可發(fā)出熒光的鈣黃綠素分子。死細(xì)胞標(biāo)記物乙啶二聚體-III(EthD-III) 對完整細(xì)胞質(zhì)膜而言既無熒光也無穿透能力。當(dāng)與死亡細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞膜完整性受到損傷時，EthD-III 進(jìn)入細(xì)胞并與細(xì)胞核結(jié)合，在細(xì)胞中產(chǎn)生明亮的紅色熒光。影響細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞毒性事件可以使用這種方法準(zhǔn)確的評估。該檢測試劑盒可對測試化合物的全濃度響應(yīng)特性進(jìn)行表征。這種免洗、均相實驗可減少因為洗滌步驟導(dǎo)致的死細(xì)胞被沖洗掉的情況。使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)和 CellReporterXpress軟件能準(zhǔn)確檢測到來自鈣黃綠素和 EthD-III 的熒光信號并獲得高質(zhì)量的圖像及分析結(jié)果。

方法

HeLa 細(xì)胞以 5,000 細(xì)胞 / 孔接種于黑色 384孔底透微孔板中，37°C, 5% CO2 孵育箱內(nèi)生長過夜。用十字孢堿 (staurosporine )( 通用蛋白激酶抑制劑和潛在的抗癌治療藥物 ) 或絲裂霉素 C ( 強效DNA交聯(lián)劑與化療藥物 ) 處理細(xì)胞 24 小時，做 4 個平行，按1:3 梯度稀釋，起始最高濃度為 10 μM 十字孢堿和 300 μM 絲裂霉素 C。化合物處理完成后，用 Live/Dead 檢測試劑結(jié)合 Hoechst33342 核染料 (Thermo Fisher)對細(xì)胞進(jìn)行染色。每孔移去一半體積液體并替換成 2x Calcein AM 和EthD-III 染色液。染色液濃度為 2 μM Calcein AM 和3 μM EthD-III。在添加 Hoechst ( 6 μM 終濃度 ) 前，孔板在 37°C, 5% CO2 下孵育30 分鐘。細(xì)胞再次以 37°C, 5% CO2 孵育15 分鐘。最后一次孵育結(jié)束后立即將孔板在 ImageXpress Pico 系統(tǒng)上用 10xPlan Fluor 物鏡進(jìn)行成像，熒光通道分別為針對 Calcein AM 的 FITC 通道、針對 EthD-III的 Texas Red 通道和針對 Hoechst 染料的 DAPI 通道。在此放大倍數(shù)下，一張單獨的圖像一個視野下可以采集多達(dá)4000-4500 個細(xì)胞，足以獲得統(tǒng)計學(xué)相關(guān)結(jié)果。