貼壁細胞培養攻略
 

一，貼壁細胞的分類及形態

貼壁細胞一般分為皮細胞型，成纖維細胞型，游走細胞型和多型細胞型。

在顯微鏡下觀察時，貼壁細胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規則的三角形或扇形或其它形態，而且晃動培養液時，細胞不動。培養細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當與底物貼附后，細胞將逐漸伸展而形成一定的形態，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等。

二，實驗材料與儀器

實驗材料：細胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培養基、100X 雙抗（鏈霉素-青霉素）、胎牛血清、細胞凍存液。

實驗儀器及耗材：培養皿或培養瓶、移液槍、離心管、記號筆、封口膜、凍存管、程序降溫凍存盒、液氮罐、離心機、37℃ 恒溫培養箱（5% 二氧化碳濃度）、倒置相差顯微鏡、冰箱、無菌細胞操作臺。

三，實驗步驟

1. 試劑準備

DMEM完全培養基（10% 胎牛血清）：44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 雙抗，搖勻，4 ℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒溫水浴鍋中預熱 15 分鐘。

PBS、完全培養基、根據細胞特性選擇合適的解離液或機械吹打消化細胞、胰蛋白酶解離劑 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA于 4℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒溫水浴中鍋預熱 15 分鐘。

2. 細胞復蘇

1) 超凈工作臺使用前紫外線照射 30 分鐘。使用前，后用 75% 酒精擦拭臺面。保持臺面干凈整潔。使用時一定打開通風。

2) 將凍存細胞從 -80 度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2 分鐘內）37 ℃ 恒溫水浴中預熱水浴鍋中（或在手心中反復摩擦），不停晃動以化凍。

3) 立刻將化凍的細胞液轉移進裝有 3 mL DMEM完全培養基的 5 mL離心管中并吸打均勻。注意液體不要留在瓶口或瓶蓋上，避免增加污染的可能。

4) 復蘇細胞時，離心機提前降溫至 4℃，以 1000 rpm 的轉速將細胞懸液離心 5 分鐘并棄上清。

5) 用 3 mL DMEM 完全培養基重懸細胞，并轉移進 6 cm 細胞培養皿中，放入細胞培養箱中。

6) 在顯微鏡下觀察復蘇細胞的狀態，并及時更換DMEM完全培養基。

7) 當細胞密度占顯微鏡視野 80%～90% 時，應進行細胞傳代。

3. 貼壁細胞傳代（以 6 cm 細胞培養皿為例）

1) 棄置原培養皿中的培養基，從培養皿邊緣加入 2 mL 預熱的 PBS 平衡鹽溶液潤洗細胞（注意不要直接沖到細胞表面）。

2) 沿培養基側壁加入1 mL 預熱的 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶完全覆蓋細胞表面。于細胞培養箱中孵育，孵育時間根據細胞的特點而定。

3) 向培養皿中加入1 mL 完全培養基中和 Trypsin 的作用，并輕輕吸打細胞表層數次。將細胞懸液轉移到 5 mL 離心管中，在室溫下以 1000 rpm 的轉速將細胞懸液離心 3 分鐘。

4) 小心棄去離心管中的上清液，使用 1mL 完全培養基輕輕重懸細胞沉淀，使其完全被吹打為單個細胞狀態，盡量減少泡沫的產生。

5) 進行細胞計數后以 1:3（1:3～1:6均可）的比例進行細胞傳代。

6) 取三只新 6 cm 細胞培養皿，每只培養皿中加入 3 mL 完全培養基，將細胞懸液平均分配至三只培養皿中，蓋上蓋子后，按照畫十字的操作，將細胞搖勻。

7) 細胞培養皿放入細胞培養箱中，繼續培養，每天觀察細胞狀態并及時更換培養液。
 

逐典TrypLUS消化液是一種胰蛋白酶類似物（Trypsin Like Enzyme），是一種通過生物工程制備的非動物源性重組蛋白酶，與胰蛋白酶有相似的解離動力學，穩定性更高，純度更好，消化更溫和，細胞毒性更低。目前主要應用于細胞培養中，可以在賴氨酸和精氨酸的C末端切割肽鍵，可以替代豬或牛胰蛋白酶（Trypsin）對貼壁細胞的消化解離。生物制藥中，GMP級別的TrypLUS能夠為疫苗生產、病毒載體生產提供高質量和高性價比的貼壁細胞消化解決方案。