自從1977年一代測序被發(fā)明以來，測序技術(shù)不斷發(fā)展。 從一代sanger測序，發(fā)展到二代測序，現(xiàn)在已經(jīng)到了三代全長測序。 其中二代測序相比于一代測序，通過將核酸片段化進行平行大規(guī)模測序，大大增加了測序的效率。早期的二代效率集中在全基因組測序和全轉(zhuǎn)錄組測序，盡管測序的效率有所增加，成本有所降低。 但是測序數(shù)據(jù)依然非常龐大，為了更進一步的節(jié)省成本，提高效率，靶向測序應(yīng)運而生。

靶向測序定義：將基因組中感興趣的區(qū)域或者位點富集出來，然后使用二代測序（NGS）方法去進行測序，包含全外顯子組（基因組蛋白編碼區(qū)域），針對感興趣的特定基因定制測序panel等。

靶向捕獲測序背景

1977年 Walter Gilbert和Frederick Sanger發(fā)明了第一臺測序儀，使用鏈終止法測序其測定了第一個基因組序列，噬菌體X174，全長5375個堿基。Sanger 測序的發(fā)明，標志著基因測序技術(shù)正式進入生命科學研究舞臺

1988年Chambehian等人首次提出多重PCR技術(shù)，為后續(xù)多重PCR擴增子測序打下基礎(chǔ)[1]

2005年Nature Method 上發(fā)表了一篇名為《Direct genomic selection》的文章，該文章利用長度為150kb生物素標記的BAC DNA和經(jīng)過處理的人類基因組DNA進行雜交，通過鏈霉親和磁珠對DNA片段進行捕獲，后續(xù)又經(jīng)過PCR擴增后進行測序。測序結(jié)果表明約~50%的序列來自于靶標區(qū)域

2008年，安捷倫聯(lián)合Broad研究所，將其超長寡核苷酸合成技術(shù)和平行測序相結(jié)合，在Nature Biotechnology發(fā)表文章，奠定安捷倫雜交捕獲測序方法學基礎(chǔ)。

2009年，安捷倫聯(lián)合華盛頓大學在Nature上發(fā)表文章，使用靶向捕獲測序技術(shù)檢測人類外顯子

同年安捷倫推出了世界上第一款商品化人類全外顯子探針產(chǎn)品。

2021 年 4 月，安捷倫宣布首款基于機器學習探針設(shè)計方案的全外產(chǎn)品—人全外顯子組 V8 (SureSelect Human All Exon V8) 正式在中國上市，繼續(xù)書寫人全外顯子靶向捕獲技術(shù)新篇章。

2022年春， Qiagen 基于多重PCR技術(shù)全新一代 QIAseq Targeted DNA Pro 在中國正式上市

目前常用的靶向測序用兩種方法：靶向捕獲法和多重PCR法（又稱擴增子測序）

雜交捕獲法

雜交捕獲法是一種把分子雜交和二代測序相結(jié)合的靶向測序技術(shù)。 該技術(shù)需要設(shè)計和生產(chǎn)和目的區(qū)域互補的探針，通過探針將目的區(qū)域的片段捕獲下來，再將不需要的部分進行洗脫。 根據(jù)雜交的狀態(tài)又可分為固相雜交和液相雜交。固相雜交就是將設(shè)計好的探針固相的芯片上探針，通過探針將目標區(qū)段捕獲。液相雜交的實驗反應(yīng)是在液體狀態(tài)中完整，探針攜帶生物素，當雜交完成后，通過鏈酶親和磁珠將探針吸附下來（此時探針有攜帶目標區(qū)段的和空探針），未被捕獲的片段被洗脫掉，再通過變性將探針和目標片段分開，然后利用磁珠將所有空探針吸附丟棄，完成捕獲。
 

圖 1 安捷倫雜交捕獲測序流程

多重PCR法

多重PCR靶向測序技術(shù)又稱擴增子靶向測序技術(shù)，是一種將多重PCR技術(shù)與二代測序技術(shù)相結(jié)合的一種靶向測序技術(shù)。 該技術(shù)首先利用多重PCR反應(yīng)，同時擴增多個目標區(qū)域序列，得到擴增子產(chǎn)物，然后通過PCR反應(yīng)或者酶連接反應(yīng)，將二代測序所需的接頭序列（adapter）引入到擴增子產(chǎn)物的兩側(cè)，得到擴增子文庫，然后進行二代測序和生信流程分析，獲取目標區(qū)域的序列信息，實現(xiàn)目標區(qū)域序列檢測的目的。常見的多重PCR靶向測序舉例：tNGS病原微生物靶向測序，用于分析病原微生物的群落組成和分布，來進行臨床病原微生物的診斷。

圖 2 Qiagen 基于SPE技術(shù)的多重PCR靶向測序流程

全基因組 vs 全外顯子 vs 多重PCR

數(shù)據(jù)評估

目標基因區(qū)域捕獲的數(shù)據(jù)質(zhì)量主要通過以下指標評價：目標區(qū)域覆蓋度、捕獲效率、目標區(qū)域覆蓋均一性等[2]。

目標區(qū)域覆蓋度：指檢測到的區(qū)域相比目標區(qū)域的比例，最理想的情況就是感興趣的目標區(qū)域都能夠被覆蓋到。但是由于在設(shè)計探針的時候會考慮各種因素，如GC含量、序列的特征、序列的拷貝數(shù)，序列相似性等問題，為了保證整體的基因捕獲效率，會選擇放棄一小部分區(qū)域的捕獲，這個比例約為0-3%。原則上來講，目標覆蓋度越高，探針或者多重PCR產(chǎn)品的性能也就越好。

捕獲效率：落在目標區(qū)域的數(shù)據(jù)占總數(shù)據(jù)的比例。捕獲效率越高，代表測序數(shù)據(jù)的利用率越高。另外在設(shè)計探針時，需要評估覆蓋位置的序列特征，如果探針有很多落在重復序列區(qū)域，或者高拷貝序列區(qū)，則探針會結(jié)合較多的非目標區(qū)域。設(shè)計更加特異性的探針能夠有效減少非特異序列的結(jié)合，提升捕獲效率。

通常影響捕獲效率的因素有以下幾點[3]：

1.高GC區(qū)域 - UTRs 和 啟動子區(qū)域通常是非常典型的高CG含量區(qū)域，這部分區(qū)域往往是低捕獲效率，并且會增加這些區(qū)域和其他區(qū)域的捕獲差別

2.DNA 質(zhì)量- 投入的DNA質(zhì)量較差, 例如FFPE樣本提取的DNA，會產(chǎn)生捕獲偏差，因為這樣樣本中部分區(qū)域往往比其他區(qū)域碎片更多。如果捕獲不平衡，就會在下游 SNP s和其他形式的分析中產(chǎn)生偏差。建議用安捷倫自動化電泳儀器對核酸樣本進行質(zhì)控，例如2100生物分析儀，Tapestation分析儀，F(xiàn)ragment analyzer等

3.DNA 投入量 - Low input DNA 在建庫過程中往往需要更多的PCR循環(huán)數(shù)來或足夠量的預文庫。增加PCR循環(huán)數(shù)，會造成更多的PCR duplicates, 會降低最終數(shù)據(jù)的有用信息。隨著技術(shù)發(fā)展，目前靶向測序所需DNA投入量已由傳統(tǒng)的微克級別下降至ng級別

4.Pseudogenes -會降低覆蓋率的均勻性

5.DNA片段大小 - 建議片段大小應(yīng)和探針設(shè)計大小想匹配以獲得更大的捕獲效率，建議用安捷倫自動化電泳儀器對樣本核酸片段進行檢測，例如2100生物分析儀，Tapestation分析儀，F(xiàn)ragment analyzer等

6.Repeat elements - 會降低reads在外顯子組中分布的均勻性，導致需要更多的測序來檢測新的SNP。

覆蓋均一性：指每個區(qū)域的覆蓋深度是不是均勻。要想獲得高均一性覆蓋度的數(shù)據(jù)，在預文庫構(gòu)建時，要保證文庫的均一性要好。例如文庫構(gòu)建時，采用無序列偏差的DNA片段化方法；采用對GC含量偏好性低的擴增酶；減少PCR富集的循環(huán)數(shù)；如果使用探針雜交捕獲方法，探針設(shè)計時要更好的計算探針的結(jié)合能力，合理調(diào)整探針比例，實驗過程中采用高度優(yōu)化的雜交緩沖液進行捕獲實驗。