DNA低甲基化介導子宮肌層干細胞發育重編程的表觀遺傳機制介紹
子宮肌瘤（uterine fibroids，UF）是生殖系統最常見的良性腫瘤，也是子宮切除手術最常見的指征。盡管患病率很高，但子宮肌瘤的確切發病機制在很大程度上仍未知。有證據表明，發育期間暴露于激素可能與子宮肌層易感UF發育有關，當發育暴露于內分泌干擾化學物質（endocrine-disrupting chemical，EDC）如己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）、鄰苯二甲酸鹽（Phthalates）和大豆植物雌激素染料染料木素（genistein），會增加動物模型中UF的發生率、多樣性和總體大小。通過充分了解環境EDC影響人類表觀基因組的機制，可以更容易地提供明確的臨床指導，以解決普通人群中常見的低水平暴露對健康的潛在影響。盡管子宮肌層干細胞（myometrial stem cells，MMSC）已被鑒定為UF的來源細胞，但由于發育暴露于EDC而導致MMSC編程的表觀遺傳機制尚未表征。
2023年8月31日，芝加哥大學婦產科Qiwei Yang為第一作者和通訊作者、Ayman Al-Hendy為共同通訊作者在《Cell Mol Life Sci》雜志發表題為“Developmental reprogramming of myometrial stem cells by endocrine disruptor linking to risk of uterine fibroids”的研究論文， 研究通過RNA-seq、ChIP-seq、RRBS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實驗，在體外和Eker大鼠模型中研究了子宮肌層干細胞（UFs的假定來源）的發育重編程，揭示了混合譜系白血病蛋白-1（mixed lineage leukemia protein-1，MLL1） / DNA低甲基化介導MMSC發育重編程的表觀遺傳機制。
標題：Developmental reprogramming of myometrial stem cells by endocrine disruptor linking to risk of uterine fibroids（內分泌干擾素對子宮肌層干細胞的發育重編程與子宮肌瘤風險相關）
時間：2023-08-31
期刊：Cellular and Molecular Life Sciences（細胞與分子生命科學）
影響因子：IF 8 / 1區
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq、RRBS、Target-BS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實驗等
研究摘要：
組織和器官生長期間很容易受環境影響，但尚不清楚在此期間暴露是如何導致表觀基因組變化和增加子宮肌瘤（UF）等激素相關疾病風險。
研究通過RNA-seq、ChIP-seq、RRBS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實驗，在體外和Eker大鼠模型中研究了子宮肌層干細胞（MMSC）的發育重編程。
研究結果表明，在Eker大鼠發育過程中，當暴露于內分泌干擾化學物質（endocrine-disrupting chemical，EDC）己烯雌酚時，MMSC的雌激素應答轉錄組發生重編程。MMSC中的重編程基因被稱為雌激素應答基因（estrogen-responsive genes，ERGs），由混合譜系白血病蛋白-1（MLL1）和DNA低甲基化機制激活。暴露于天然類固醇的Eker大鼠在發育性暴露于EDC后，MMSC中ERG表達顯著上調，從而增強雌激素活性。
本研究揭示了MLL1/DNA低甲基化介導MMSC重編程的表觀遺傳學機制。EDC暴露表觀靶向MMSC，并導致ERG亞群表達的持續變化，在ERG上產生激素印記，導致“超雌激素”表型，并增加UFs的激素依賴性風險。
研究結果
（1）Eker大鼠EDC暴露與VEH暴露MMSC中差異轉錄模式的鑒定
圖2：發育性EDC誘導大鼠MMSC基因重編程
（2）發育性EDC暴露重編程MMSC中的雌激素應答基因
（3）EDC暴露激活MLL1表觀遺傳通路并通過H3K4me3破壞MMSC的表觀基因組
圖4：EDC發育性暴露激活MLL1
（4）EDC暴露重編程甲基化并導致ERG表達變化。
圖7：發育性EDC暴露誘導甲基化組變化并通過DNA啟動子甲基化導致ERG重編程
圖8：DES-MMSC中ERG的特異性重編程影響差異子宮肌層細胞（differential myometrial cells，DMC)
研究結論
本研究通過RNA-seq、ChIP-seq、RRBS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實驗等多組學分析，表明了外源性雌激素（EDC）直接靶向并影響MMSC的表觀遺傳學，而MMSC是UF的細胞來源。通過表觀基因組分析揭示了調控MMSC轉錄譜機制的新見解。早期暴露于EDC（如DES）會導致MMSC中組蛋白和DNA甲基轉移酶介導的多種基因表達模式發生顯著變化，包括各種雌激素應答基因（ERG）。這些基因表達的變化改變了MMSC表征，導致“超雌激素（hyper-estrogenic）”表型，其特征是DNA修復能力降低和激素依賴性子宮疾病（如UFs）的風險增加。
參考文獻：
Yang Q, Ali M, Treviño LS, Mas A, Al-Hendy A. Developmental reprogramming of myometrial stem cells by endocrine disruptor linking to risk of uterine fibroids. Cell Mol Life Sci. 2023 Aug 31;80(9):274.
2023年8月31日，芝加哥大學婦產科Qiwei Yang為第一作者和通訊作者、Ayman Al-Hendy為共同通訊作者在《Cell Mol Life Sci》雜志發表題為“Developmental reprogramming of myometrial stem cells by endocrine disruptor linking to risk of uterine fibroids”的研究論文， 研究通過RNA-seq、ChIP-seq、RRBS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實驗，在體外和Eker大鼠模型中研究了子宮肌層干細胞（UFs的假定來源）的發育重編程，揭示了混合譜系白血病蛋白-1（mixed lineage leukemia protein-1，MLL1） / DNA低甲基化介導MMSC發育重編程的表觀遺傳機制。
時間：2023-08-31
期刊：Cellular and Molecular Life Sciences（細胞與分子生命科學）
影響因子：IF 8 / 1區
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq、RRBS、Target-BS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實驗等
研究摘要：
組織和器官生長期間很容易受環境影響，但尚不清楚在此期間暴露是如何導致表觀基因組變化和增加子宮肌瘤（UF）等激素相關疾病風險。
研究通過RNA-seq、ChIP-seq、RRBS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實驗，在體外和Eker大鼠模型中研究了子宮肌層干細胞（MMSC）的發育重編程。
研究結果表明，在Eker大鼠發育過程中，當暴露于內分泌干擾化學物質（endocrine-disrupting chemical，EDC）己烯雌酚時，MMSC的雌激素應答轉錄組發生重編程。MMSC中的重編程基因被稱為雌激素應答基因（estrogen-responsive genes，ERGs），由混合譜系白血病蛋白-1（MLL1）和DNA低甲基化機制激活。暴露于天然類固醇的Eker大鼠在發育性暴露于EDC后，MMSC中ERG表達顯著上調，從而增強雌激素活性。
本研究揭示了MLL1/DNA低甲基化介導MMSC重編程的表觀遺傳學機制。EDC暴露表觀靶向MMSC，并導致ERG亞群表達的持續變化，在ERG上產生激素印記，導致“超雌激素”表型，并增加UFs的激素依賴性風險。
圖1：實驗圖
Eker大鼠幼崽在出生后10-12天暴露于VEH（每天皮下注射50μl芝麻籽油，vehicle，n=5）和EDC（每天皮下注射10μg己烯雌酚，n=5）。幼崽在5月齡時被處死，代表早期成年期。從大鼠中分離出子宮肌層組織，并使用Stro-1/CD44表面標記進行MMSC分離。利用多組學分析，包括RNA-seq、ChIP-seq和RRBS，分別鑒定轉錄組、組蛋白修飾和DNA甲基化的整體變化。同時還進行目標基因的亞硫酸鹽NGS測序（Target-BS），以檢測基因CpG島的DNA甲基化。研究結果
（1）Eker大鼠EDC暴露與VEH暴露MMSC中差異轉錄模式的鑒定
圖2：發育性EDC誘導大鼠MMSC基因重編程
- EDC己烯雌酚組和VEH組的各5只動物混樣，采用FACS策略進行MMSC分離。餅圖顯示通過RNA-seq檢測的EDC -MMSC和VEH-MMSC之間的RNA表達變化基因百分比；FDR<0.05時臨界值為兩倍。
- EDC-MMSC與VEH-MMSC中排名前20位的up-DEG列表。
- EDC-MMSC與VEH-MMSC中排名前20位的down-DEG列表。
- 過表達分析表明，包括雌激素反應通路（紅色）在內的多種UF相關通路受早期EDC暴露影響。
- 通過Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析發育性EDC己烯雌酚暴露對相關疾病的影響，用紅色突出顯示
（2）發育性EDC暴露重編程MMSC中的雌激素應答基因
圖3：轉錄譜分析顯示雌激素應答基因的重編程
- RNA-seq分析，與VEH-MMSCs相比，EDC-MMSC中RNA表達變化的ERG百分比餅圖。
- 在EDC-MMSC與VEH-MMSC中RNA-seq分析顯示差異表達的前20個up-ERG列表。
- 在EDC-MMSC與VEH-MMSC中RNA-seq分析顯示差異表達的前20個down-ERG列表。
- 與VEH-MMSC相比，EDC-MMSC中的ER-a表達上調。從EDC-MMSC和VEH-MMSC制備裂解液，并使用ER-a抗體進行Western blot分析。
- 比較EDC-MMSC和VEH-MMSC在有或無雌激素（10nM）時的螢光素酶活性。
- DES（己烯雌酚，diethylstilbestrol）-MMSC和VEH-MMSC中有或無雌激素時ERG表達變化。學生t檢驗，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001
（3）EDC暴露激活MLL1表觀遺傳通路并通過H3K4me3破壞MMSC的表觀基因組
圖4：EDC發育性暴露激活MLL1
- 用抗MLL1、H3K4me3和Cd9抗體進行Western blotting以分析MLL1C（MLL1活化形式）、H3K4me3和Cd9水平。總H3和β-肌動蛋白用作負載對照。生物學重復（n=3）進行定量。
- EDC-MMSC與VEH-MMSC中H3K4me3染色和定量分析的共聚焦成像圖（Confocal imaging）。使用三個單獨的細胞蓋片進行定量。學生t檢驗，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
圖5：EDC暴露破壞MMSC的表觀基因組
- ERG peaks數量餅圖。
- EDC暴露將H3K4me3與ERG RNA表達整合。
- EDC調控H3K4me3 peaks的ERG。
- Integrative Genomics Viewer直方圖顯示Esr-1、Cxcl12、Cd9、Mpped2和Tgm2中的H3K4me3占比（左側panel）。對于每個基因，上方和下方的瀏覽器圖像顯示VEH-MMSC（藍色軌跡）和EDC-MMSC（紅色軌跡）中H3K4me3 peaks分布的選定區域的擴展視圖。中間panel：通過ChIP-qPCR對H3K4me3靶基因進行定向ChIP測序驗證。右側panel；通過q-PCR進行RNA測序驗證。學生t檢驗，*p<0.05，**p<0.01，***p < 0.001
圖6：Tasp1敲除逆轉了EDC暴露誘導的重編程ERG
- 在EDC-MMSC中使用shRNA慢病毒（pLKD-TASP1）質粒敲低TASP1表達后，進行Western blot分析以確定TASP1在MLL1介導的表觀遺傳學通路中的作用。分別使用抗TASP1、H3K4me3和CD9抗體進行Western blot分析TASP1、H3K4me3、和CD9蛋白的表達水平（左圖）。生物學重復（n=3）用于定量。使用Image J（右圖）進行定量分析。
- EDC暴露誘導的6個重編程ERG（Esr-1、Pgr、Cxcl12、Ar、Cd9和Tgm2）表達上調被EDC-MMSC中Tasp1敲除所逆轉。通過qPCR檢測EDC-MMSC炒慢病毒（scrambled lentivirus）感染或三種不同個體Tasp1敲低慢病毒的ERG RNA表達。*p<0.05，**p<0.01，***p < 0.001；學生t檢驗
（4）EDC暴露重編程甲基化并導致ERG表達變化。
圖7：發育性EDC暴露誘導甲基化組變化并通過DNA啟動子甲基化導致ERG重編程
- Western blot分析檢測VEH-MMSC和EDC-MMSC中DNMT3A的蛋白水平。
- VEH-MMSC和EDC-MMSC中DNA甲基化基因熱圖。
- 通過靶向亞硫酸鹽NGS檢測Esr1的甲基化分布，覆蓋其CpG島上的14個CpG位點。
- 具有H3K4me3和DNA甲基化狀態的EDC調控基因百分比。
- 具有H3K4me3和DNA甲基化狀態的基因數量。
- 綜合基因組查看器（IGV）圖和整合多組學分析。EDC-MMSC中H3K4me3富集、DNA甲基化和RNA表達peaks用紅色表示，而VEH-MMSC中的H3K4me3富集、DNA甲基化和RNA表達peaks用藍色表示。學生t檢驗，***p<0.001
- DES-MMSC和DES-DMC之間的ERG（包括Bcl11b、Cd9、Cxcl12和Tgm2）差異表達條形圖。
- H3K4me3狀態與MMSC和DMC之間重編程ERG的比較表達相關性，以VEH-MMSC為參考。p值顯示Stro-1/CD44雙陽性和雙陰性細胞之間基因表達的顯著差異。淺藍色背景的基因表明基因表達的兩個比較（Stro-1/CD44雙陽性細胞 vs 雙陰性細胞，或Stro-1+/CD44+-DES vs VEH）呈負相關。白色背景基因表明兩個比較呈正相關。
- 實驗設計示意圖。從EDC-MMSC和VEH-MMSC中制備無血清條件培養基（CM）。來自成年大鼠子宮肌層的DMC，分別在EDC-MMSC和VEH-MMSC的CM中培養2天。
- MTT檢測EDC-MMSC和VEH-MMSC的CM對DMC增殖的作用。
- qPCR檢測EDC-MMSC和VEH-MMSC的CM對DMC中β-catenin和β-catenin調控基因（Angpt2、Med12l和Pitx2）表達的影響。*p<0.05，**p<0.01，***p < 0.0001
研究結論
本研究通過RNA-seq、ChIP-seq、RRBS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實驗等多組學分析，表明了外源性雌激素（EDC）直接靶向并影響MMSC的表觀遺傳學，而MMSC是UF的細胞來源。通過表觀基因組分析揭示了調控MMSC轉錄譜機制的新見解。早期暴露于EDC（如DES）會導致MMSC中組蛋白和DNA甲基轉移酶介導的多種基因表達模式發生顯著變化，包括各種雌激素應答基因（ERG）。這些基因表達的變化改變了MMSC表征，導致“超雌激素（hyper-estrogenic）”表型，其特征是DNA修復能力降低和激素依賴性子宮疾病（如UFs）的風險增加。
圖9：MMSC表觀基因組發育重編程模型
環境風險因素（包括EDC暴露）通過組蛋白修飾和DNA甲基化破壞表觀基因組，從而導致MMSC向UF起始細胞轉化，并最終導致UF形成參考文獻：
Yang Q, Ali M, Treviño LS, Mas A, Al-Hendy A. Developmental reprogramming of myometrial stem cells by endocrine disruptor linking to risk of uterine fibroids. Cell Mol Life Sci. 2023 Aug 31;80(9):274.
標簽：
DNA甲基化
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