大家好，這里是專注表觀組學十余年，領跑做組學科研服務的易基因。今天給大家科普一種全新的檢測DNA羥甲基化的技術：APOBEC-coupled epigenetic sequencing，簡稱【ACE-seq】。

前言
DNA序列中胞嘧啶（C）5’ 碳位結合一個甲基基團而轉變成5mC的現象稱為DNA基甲基化。在5mC去甲基化的過程中，其會被氧化成5hmC，這種新的修飾稱為DNA羥甲基化。

如圖

因為5hmC是5mC去甲基化的中間產物，所以對于多細胞來說，同一個C位點上不同細胞往往會存在5mC或5hmC不同修飾，而5mC與5hmC對基因表達的調控作用又完全不同：啟動子區的DNA甲基化對基因表達的有抑制作用，DNA羥甲基化則會促進基因的表達。因此，對5mC及5hmC的水平進行精確地定量并分別研究十分有必要。

了解易基因的小伙伴肯定知道，易基因的看家本領OX-BS技術可以輕松的開展DNA羥甲基化的相關研究，雖然神器在手，但是不少老師反應，OX-BS研究羥甲基化成本還是過高，因為畢竟要兩個文庫結合，180G的測序數據都是白花花的銀子啊。易基因的研發小伙伴牢記老師們的反饋，日以繼夜的奮戰終于在6月之際。推出新一代羥甲基化研究科研服務產品‍：APOBEC-coupled epigenetic sequencing ，簡稱(ACE-seq)。

ACE-seq是一種全新的檢測DNA羥甲基化的技術，由美國賓夕法尼亞大學Emily K Schutsky等在2018年發表在Nature Biotechnology雜志上。不同于傳統的BS-Seq，該技術使用AID/APOBEC家族DNA脫氨酶APOBEC3A (A3A)代替化學脫氨，保證了DNA的完整性。A3A能夠特異地脫去C及5mC的氨基使其變為U，而5hmC則因為不被該酶識別，測序時仍被檢測為C。這樣，便將5hmC與C及5mC區分開來。

該技術原理示意圖如下：

首先，利用T4 β-葡糖基轉移酶（βGT）將5hmC轉化成5ghmC，5ghmC不會被A3A酶脫氨基；然后，利用A3A酶特異去除C和5mC的氨基，使其轉變成U，而5hmC保持為C，從而將5hmC和C/5mC區分開來。

ACE-Seq具有以下優勢：
(1)檢測范圍為全基因組，可以得到基因組上大部分C位點的羥甲基化水平。
(2)單堿基分辨率。能夠檢測單個C堿基的羥甲基化水平，精確度高。
(3)低起始量。ACE-Seq利用脫氨酶實現5hmC與C及5mC的區分，反應條件溫和，不破壞基因組，大大減少基因組DNA的損失，因此起始DNA量比常規的oxBS技術降低100倍。
(4)高準確性。絕大部分甲基化修飾的C都被轉化成U，而絕大部分經過糖基化修飾的5hmC（5ghmC）則保持為C，表明該技術具有充分的可靠性。

如下圖：

(5)經濟性。僅需一個文庫解決問題，羥甲基化研究成本大大降低。

ACE-Seq獨有的優勢使其在羥甲基化檢測領域擁有巨大的潛力。‍

為了讓大家全面理解掌握自己究竟該選擇哪種羥甲基化研究技術，我們再來溫習一下oxWGBS-Seq。該技術將傳統的BS-Seq技術與化學氧化相結合，先利用高釕酸鉀將DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亞硫酸鹽處理，5fC和沒有任何修飾的C就被轉化成U，而5mC則不會被轉化，仍然保持為C。

原理示意圖如下：

(1)可以同時檢測甲基化和羥甲基化的水平。
(2)檢測范圍為全基因組，可以得到基因組上大部分C位點的甲基化和羥甲基化水平。
(3)單堿基分辨率。能夠檢測單個C堿基的甲基化和羥甲基化水平，精確度高。‍

由于以上優點，oxWGBS被稱為精準甲基化和羥甲基化檢測的“金標準”。

根據oxWGBS還可以衍生出oxRRBS技術。oxRRBS是簡化代表性重亞硫酸鹽測序（RRBS-Seq）技術與化學氧化技術的結合，可以針對基因組上CpG含量高的區域（如CGI，啟動子等重要的調控區域）進行甲基化及羥甲基化水平檢測。由于oxRRBS只針對CpG含量高的區域進行檢測，而這些區域往往是重要的調控區域，使得oxRRBS技術能夠以較低的成本檢測關鍵基因組區域的甲基化及羥甲基化水平。

然而以上兩種技術有兩個共同的缺點。

首先，由于重亞硫酸鹽處理對DNA有強烈的破壞作用，導致建庫過程中會損失大量DNA，因此該技術需要的DNA起始量較高；另外，由于該技術需要構建兩個文庫，會導致成本的上升。

此外，還可以利用hMeDIP-Seq技術來檢測DNA羥甲基化。hMeDIP利用5hmC特異性抗體富集基因組上發生羥甲基化的DNA片段，結合高通量測序，檢測基因組上羥甲基化的區域。

原理示意圖如下：

該技術針對羥甲基化的片段進行測序和定量，成本大大降低。但該技術無法達到單堿基分辨率，也無法得到精確的羥甲基化率，只能得到羥甲基化修飾的信號強度。

參考文獻：
doi:10.1038/nbt.4204