文章標題：Metabolite asymmetric dimethylarginine (ADMA) functions as a destabilization enhancer of SOX9 mediated by DDAH1 in osteoarthriti
發表期刊：Science Advances
影響因子：14.95
作者單位：浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院

百趣提供服務：iTRAQ/TMT標記定量蛋白質組

研究背景
骨關節炎(Osteoarthritis，OA)是一種退行性疾病，伴有一系列代謝變化和酶的改變。本研究報道了二甲基精氨酸二甲氨基水解酶-1(dimethylarginine dimethylaminohydrolase-1, DDAH1)的下調伴隨著變性軟骨細胞和OA樣本中不對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)的增加。整體或條件性敲除軟骨細胞的ADMA水解酶DDAH1加速了小鼠OA的發展。ADMA誘導軟骨細胞變性和衰老，減少細胞外基質沉積，從而加速OA的進展。ADMA同時與SOX9及其去泛素化酶USP7結合，阻斷USP7對SOX9的去泛素化作用，從而導致SOX9降解。OA患者滑液中ADMA水平升高，對OA診斷具有良好的敏感性和特異性的預測價值。因此，激活DDAH1以降低ADMA水平可能是OA治療的潛在治療策略。

技術路線

研究結果
01 骨性關節炎軟骨細胞中ADMA升高會引發軟骨變性
針對6名OA患者和6名相對健康的患者（膝關節骨折，無OA病史）開展代謝組學分析，兩組出現一系列的代謝物差異。在上調TOP25的代謝物中，ADMA具有最高的統計學顯著性，其異構體對稱二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine, SDMA)沒有實質性變化（圖1 B）。為了研究ADMA是否能在體內誘導OA，作者在內側半月板失穩(destabilization of the medial Meniscus, DMM)手術1周后將ADMA直接注射到小鼠膝關節。ADMA在DMM手術中顯著加速軟骨退變，促進骨贅形成。此外，免疫組織化學染色證實，暴露于ADMA的軟骨中II型膠原和聚集蛋白的表達降低。熱板分析、旋轉桿實驗和野外實驗顯示，注射ADMA的小鼠疼痛閾值和移動能力明顯降低�？傊�，這些數據表明，退化軟骨細胞中ADMA的增加會引發軟骨變性和衰老。

02DDAH1下調導致OA患者ADMA升高
ADMA是在精氨酸與甲基化殘基的蛋白分解過程中釋放出來的，隨后被DDAH家族或AGXT2水解。作者使用DDAH1抑制劑PD 404182來探究DDAH1在OA中的作用。結果顯示ADMA在PD 404182處理的軟骨細胞中急劇升高（圖1 C）。此外，ADMA在DDAH1−/−（DDAH1全基因敲除小鼠）原代軟骨細胞中升高（圖1 D）。這些數據表明，DDAH1在OA進展中受到抑制，從而增加了軟骨細胞中的ADMA水平。此外，Western blotting和免疫組織化學驗證了DDAH1的缺失（圖1 H）。微團培養和3D瓊脂糖培養顯示，DDAH1−/−原代軟骨細胞中ECM沉積較低（圖1 E、F）。雖然在20周齡的DDAH1 - / -小鼠中沒有觀察到明顯的OA相關表型，但DDAH1缺失明顯加速了DMM誘導的OA小鼠的軟骨退變（圖1 G）。免疫組織化學顯示，DDAH1 - / -小鼠軟骨中的II型膠原和聚集蛋白減少（圖1 H），可以確定ADMA在DDAH1的作用下可以快速水解。
 

圖1. DDAH1上調ADMA加速OA進

03軟骨特異性DDAH1參與骨關節炎進展
為了進一步研究DDAH1的作用，作者建立DDAH1fl/fl（DDAH1條件敲除小鼠）小鼠模型，發現在軟骨細胞中ADMA表現出高表達狀態。RT-PCR結果顯示合成代謝因子（COL2A1和ACAN）降低，分解代謝因子（MMP3和MMP13）升高（圖2 A）；此外，DDAH1缺失后，aggrecan和COL2A1的蛋白表達顯著下調（圖2 B）。為了排除DDAH1對骨骼的影響，作者使用Col2-CreERT2和ACAN-CreERT2小鼠產生DDAH1條件敲除小鼠，使軟骨細胞中DDAH1基因條件缺失。與對照組相比，軟骨中DDAH1的缺失會導致DMM手術后更嚴重的軟骨損傷（圖2 C）。此外，DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2小鼠軟骨中II型膠原蛋白和聚集蛋白的表達明顯降低（圖2 D）。

同時，在DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl, ACAN-CreERT2小鼠中觀察到更多的骨贅（圖2 E）。作者也對軟骨下骨密度進行了研究，發現DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl, ACANCreERT2小鼠均表現出更高的軟骨下骨體積（圖2 F）。熱板、旋轉桿和野外實驗表明，DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2小鼠對疼痛更敏感，并有一定程度的運動障礙（圖2 G）。LC-MS證實了DDAH1過表達的軟骨細胞中ADMA水平降低。說明DDAH1可部分逆轉DMM誘導的小鼠骨性關節炎。
 

圖2. 特異性敲除DDAH1加速OA發展

04ADMA激活SOX9的泛素-蛋白體途徑
ADMA作為一種內源性一氧化氮合酶抑制物，可以通過NO影響病理生理過程，通過實驗證明ADMA誘導軟骨細胞退變不依賴于NOS/NO途徑。為了更好地了解ADMA誘導軟骨細胞變性機制，作者對ADMA處理的細胞進行了TMT定量蛋白質組學研究（上海百趣生物提供）。KEGG分析揭示了幾種豐富的OA相關通路，如ECM受體相互作用、TNF信號通路、細胞衰老和糖胺聚糖生物合成（圖3 A）。

火山圖顯示，分解代謝因子（MMP3和MMP13）、衰老標志物(P21)和炎癥趨化因子（CCL2、CCL5和CXCL10）上調，合成代謝因子（aggrecan、COL2A1和SOX9）下調（圖3 B)。先前的一項研究表明，SOX9缺乏導致健康軟骨蛋白聚糖丟失，并導致創傷性OA后嚴重的軟骨侵蝕。作者接下來重點關注SOX9是否是ADMA影響的核心蛋白。RT-PCR顯示，DDAH1的缺失沒有顯著改變SOX9 RNA水平（圖3 C）。然而，暴露于ADMA或DDAH1缺失的軟骨細胞中，SOX9蛋白表達顯著下調（圖3 D和3 E）。

此外，免疫組織化學表明，關節注射PD 404182的小鼠（圖3 F）或DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl, ACAN-CreERT2小鼠的軟骨中SOX9的表達急劇下降（圖3 G、 H）。此外，暴露于ADMA的細胞中SOX9的半衰期比對照細胞短，表明ADMA導致SOX9的不穩定性。MG132（一種蛋白酶體抑制劑）處理阻斷了SOX9的降解，而氯喹（一種溶酶體抑制劑）則沒有，這表明SOX9的降解依賴于蛋白酶體而不是溶酶體途徑（圖3 I、J）。此外，ADMA誘導的SOX9降解在過表達DDAH1的軟骨細胞中部分逆轉（圖3 K）。值得注意的是，ADMA增加了泛素化SOX9的水平（圖3 L）。總之，ADMA通過泛素-蛋白酶體途徑觸發SOX9降解。
 

圖3. ADMA通過泛素-蛋白酶體途徑誘導SOX9降解

05ADMA阻斷SOX9和USP7之間的相互作用
在證明ADMA通過泛素-蛋白酶體途徑加速SOX9降解后，作者下一步的目標是確定ADMA如何影響SOX9水平。作者合成了生物素-ADMA，將其與軟骨細胞培養液培養，質譜檢測，結合UbiBrowser數據庫，預測了SOX9相關E3泛素連接酶或去泛素化酶(Deubiqui-tinating enzymes, DUBs)特異性相互作用的蛋白質，發現DUB USP7可能參與其中（圖4 A、B）。免疫沉淀結果顯示USP7能夠降低泛素化的SOX9。通過Western blotting驗證了USP7和ADMA之間的相互作用。質譜結果顯示ADMA與SOX9相互作用，Western blotting進一步證實了這一點。

那么，進一步探討ADMA是否與這兩種蛋白質直接結合，系列分子實驗結果表明，ADMA能夠與SOX9和USP7之間的相互作用區域結合，主要是阻止它們的結合。免疫共沉淀證實了SOX9和USP7之間的相互作用，而ADMA可以削弱這種相互作用（圖4  C~J）。為了證實猜想準確性，抑制USP7后，ADMA不影響SOX9的表達和對SOX9的泛素化。這些結果證實了ADMA阻斷USP7對SOX9去泛素化作用。

圖4. ADMA阻斷SOX9和USP7之間的相互作用

06滑液中的ADMA是一種潛在的OA診斷標志物
為了研究ADMA在人類滑膜液中是否增加，作者進行了回顧性研究（圖5 A）。根據納入標準，納入350例OA患者(n = 114 in center1, n = 112 in center 2, and n = 124 in center 3)，并根據Kellgren-Lawrence (KL)分級分為輕度、中度和重度3個階段（圖5 B）�？紤]到OA是一種與年齡相關的退行性疾病，三個階段的患者在性別、身高、體重和身體質量指數(BMI)方面沒有明顯差異，但年齡略有差異（圖5 C）。

和預期一樣，與相對健康的患者相比，OA患者滑液中表現為主要ADMA增加，而SDMA沒有表現出臨床意義。嚴重OA患者滑液中ADMA水平明顯高于中度OA患者（圖5 D），表明ADMA可能與OA進展呈正相關。根據Pearson相關分析，滑液中的ADMA與膝關節社會評分（膝關節OA的臨床評估評分）（圖5 E）和最小內側關節間隙寬度(x線測量關節間隙狹窄和評估OA的關鍵指標)呈負相關（圖5 F）。此外，ADMA與年齡有輕微的正相關，與BMI無關（圖5 G、H）。受試者工作特征(ROC)曲線顯示，滑液ADMA能將OA患者與相對健康的患者區分開來，有利于OA的早期診斷，具有良好的敏感性和特異性；但是，不能鑒別晚期OA和早期OA（圖5 I）。這些數據表明，滑液中的ADMA可能是OA診斷的潛在標志物。
 

圖5. ADMA在人類滑膜液中的變化結果

總結
本文中，研究團隊在退化的軟骨細胞中發現了新的生物標志物ADMA，ADMA的增加伴隨著DDAH1的下調。在DDAH1的調節下，ADMA促進軟骨細胞和軟骨的退變與衰老，從而加速OA的進展，而不依賴于NOS/NO途徑。相反，ADMA直接結合SOX9和USP7并阻斷它們的相互作用區域，通過泛素-蛋白酶體途徑促進SOX9降解。因此，靶向DDAH1可能為OA治療提供新的方向。