糖基化修飾是蛋白質中最普遍的翻譯后修飾，在調節生理和病理過程中發揮著非常重要的作用。近年來，基于質譜的定量糖蛋白組學闡明了糖基化修飾/糖蛋白在生理和病理過程中的作用，并逐漸成為一種篩選潛在生物標志物的重要方法。然而由于復雜樣品中糖肽的濃度比較低、糖鏈組成非常復雜等原因，對于完整N-糖肽的定性定量分析仍然存在著一定的難度。肝臟疾病是困擾我國人群的主要疾病之一，亟需篩選生物標志物用于早期的臨床檢測和診斷。

2022年4月，復旦大學生物醫學研究院陸豪杰教授團隊在National Science Review（IF 17.275）發表了一篇題為“High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis”的研究文章，該文中提出了一種高通量完整N-糖肽定量的研究方法（HTiGQs），并利用完整N-糖肽方法分析篩選了不同肝臟疾病的生物標志物、采用PRM的方式驗證了肝臟疾病不同階段的糖基化表達的變化。
研究材料：
肝臟疾病患者和健康對照的血清

技術路線：
步驟1：HTiGQs增強了完整N-糖肽的鑒定和定量；
步驟2：大規模血清糖蛋白組學的表征；
步驟3：肝臟疾病生物標志物的篩選。

研究結果：

1. HTiGQs增強了完整N-糖肽的鑒定
作者的研究路線如圖1所示，首先利用10-plex TMT進行糖肽標記，隨后在HCD和ETD-MS/MS模式下，加入DMEN進一步標記N-糖肽。待驗證標記成功后，作者比較了有標記和沒有標記的N-糖肽的鑒定結果，研究發現標記后鑒定到的N-糖肽數量是未標記的三倍（圖2a）且肽譜匹配得分更可靠(圖2b), ETD-MSMS的鑒定數量較HC模式下更多（圖2c）,且DMEN標記顯著增加了糖肽的電荷數（圖2d-2e），進而提高了ETD-MS/MS模式下對完整N-糖肽檢測的可靠度（圖2f）。   雖然TMT標記提高了單個實驗的通量，但結果發現TMT標記后的糖肽的報告離子強度較低，因此為了平衡報告離子強度和識別的糖肽數量之間的關系，作者研究了不同HCD碰撞能和ETD觸發獲取方法的組合（圖3a），結果發現sceHCD-pd-ETD 50±10的方法對于完整N-糖肽的鑒定和定量是最優的采集方法（圖3b-3c）。作者進一步用IgG標品驗證HTiGQs的動態范圍和準確度，結果證實了HTiGQs對于完整N-糖肽定量的準確性（圖3d-3f）。  
3. 大規模血清糖蛋白組學的表征
為了測試HTiGQs對復雜生物樣本糖基化分析的適用性，作者使用HTiGQs方法對人血清中的糖蛋白組進行了研究。結果發現與非標記完整N-糖肽相比，標記后完整N-糖肽的數量增加了75%以上(圖4a)。使用HTiGQs方法鑒定到N-糖基化修飾位點的motif分析結果與已知的N糖基化位點序列一致（N-X-S/T）(圖4c)。隨后作者對鑒定到的N糖基化蛋白進行了GO富集分析（圖4d）、糖型分析（圖4e）、糖蛋白-糖鏈網絡圖（圖4f）、糖鏈共現網絡圖（圖4g）,結果表明：巖藻糖化和唾液酸化是血清中最常見的糖基化類型、血清糖蛋白高度復雜的異質性（多個蛋白含有5個或更多的糖基化位點）、巖藻糖化的聚糖經常同時發生且它們還與其他幾個復雜的和唾液酸化的聚糖群同時發生。綜上所述，HTiGQs能夠在復雜的生物樣本(如血清)中大規模表征完整N-糖肽。
4. 肝臟疾病生物標志物的篩選
已知免疫球蛋白IgG的N-糖基化與疾病的發病機制和進展密切有關。本研究中作者分析了90例不同嚴重程度的人類肝病患者（慢性HBV感染、CIR（肝硬化）和HCC（肝細胞癌））和健康對照（HC）的血清中IgG 完整N-糖肽的變化，確定與某些肝臟疾病相關的特異性糖肽生物標志物。

此次研究總共鑒定到313個IgG完整N-糖肽。通過顯著差異比較分析篩選后，作者選擇27個顯著差異糖肽（圖5d）作為生物標志物的分析。研究發現糖肽IgG1-H3N5F1和IgG1-H3N4F1可以將HCC組和HC組區分開來，IgG2-H6N3F1可用于區分HBV和CIR（圖5f）。多個糖肽的聯合：IgG1-H3N5F1和IgG4-H4N3可以有效區分HBV、CIR和HCC組和HC組（圖5g）。

隨后，作者在34例肝病血清和11例健康對照中使用PRM方法驗證了肝臟疾病不同階段之間的糖基化表達變化。結果表明IgG1-H3N5F1可以有效區分HCC和HC組（圖6）。  
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