椎間盤中央膠質樣部分髓核（NP）變性是椎間盤退變(IVDD)和腰背痛發生的主要原因。目前的治療方法僅限于緩解背部癥狀，這使得該病擁有極高的復發率。NP細胞(NPCs)是NP組織中分布的主要細胞類型，它們負責維持組織內環境的穩定。NPCs增殖緩慢，缺乏自我再生能力，這增加了疾病治療的難處。目前對NPCs的病理生理學研究通常在轉錄組和表觀基因組分析水平。然而，組織水平的分辨率掩蓋了細胞間和細胞類型內改變的異質性。

來自澳大利亞悉尼大學和昆士蘭大學以及來自河北醫科大學的研究人員在Advance Science（IF 16.8）雜志上發表了題為“Single-Cell Transcriptome Profiling Reveals Multicellular Ecosystem of Nucleus Pulposus during Degeneration Progression”的文章，該文章利用單細胞轉錄組測序技術發現了與IVDD發展相關的細胞類群以及這些細胞間的相互作用關系，揭示了NP中NPCs型的復雜性和表型特征，從而為IVDD治療提供了新的見解和線索。

研究材料
8例不同退化程度患者的脊柱髓核組織

技術路線
· 步驟1：單細胞轉錄組構建NPCs的單細胞圖譜；
· 步驟2：通過分化軌跡分析發現IVDD發展的關鍵NPCs細胞群；
· 步驟3：對免疫細胞群進行聚類分析發現關鍵免疫類細胞群；
· 步驟4：通過細胞通訊分析結果構建以NPCs細胞為核心的細胞調控網絡模型。

研究結果
1. 單細胞轉錄組構建NP組織的單細胞圖譜
作者分離了8名不同程度變性的IVDD患者的NP組織用于單細胞檢測，根據高表達基因和已發表的文章對NPCs進行鑒定注釋，共確定了6個細胞亞群。這表明NP細胞群具有較強的異質性。接下來，作者分析了退化等級與細胞群類型之間的相關性。HT-CLNPs和regNPCs是II級椎間盤的主要細胞類型。effectNPCs和HT-CLNPs是III級和IV級椎間盤的主要細胞類型。對于V級椎間盤，fibroNPCs和adhesionNPCs是主要的細胞類型。此外，IVDD嚴重程度從II級到V級，伴有adhesionNPCs和fibroNPCs的比例增加，而homeostaticNPCs的比例則呈現相反的趨勢。而實驗結果也驗證了這一觀點。除此之外，通過轉錄因子預測分析發現了 一組與退化程度相關的轉錄因子，其中包括AR、REL、LMX1A和PRDM1都是首次發現。而基于IVDD分級相關的差異分析，作者發現了一組可能促進脊柱退性的信號通路，包括抗原加工和遞呈通路、TNF通路、MAPK通路和Hippo通路等。

圖1 人類NP組織細胞圖譜的鑒定以及與IVDD嚴重程度的相關性

2. 通過分化軌跡分析發現IVDD發展的關鍵NPCs細胞群
為了分析各亞群間的功能差異，對鑒定的NPCs亞群研究其生物學過程。EffectorNPCs高表達代謝相關基因（如類固醇生物合成、糖胺聚糖代謝等）。RegNPCs高表達細胞炎癥反應和內源性刺激反應相關的基因（如CXCL3、IL-6和CHI3L1等）。homeostaticNPCs則高表達細胞穩態相關的基因（如翻譯調節、蛋白/RNA代謝等）。AdhesionNPCs則顯著富集與細胞遷移和細胞基質黏附相關的基因。此外，作者對這些不同的NPCs進行了分析，包括神經分布、血管生成和細胞衰老等因素，這些都與IVDD發展相關。

接著，作者通過擬時序分析發現這些細胞譜系的分化軌跡，順序依次為：fibroNPCs→AdhesionNPCs→EffectorNPCs→RegNPCs→HT-CLNPCs→homeostaticNPCs。通過RNA velocity分析發現了同樣的分化軌跡，并且分析了fibroNPCs中一些關鍵基因（如Col14A1、CoL12a1、CHAD、CRTAC1、TNC和Lamb1等）。這些結果說明fibroNPCs具有祖細胞的特征。隨后，作者通過相關分析和實驗驗證了這一結論，并指出在fibroNPCs未來的研究中可能是一個潛在的治療靶點。

圖2  單細胞揭示了NPCs的轉錄特征

圖3  分化軌跡分析揭示IVDD終末期的祖細胞類型

3. 對免疫細胞群進行聚類分析發現關鍵免疫類細胞群
除NPCs外，NP組織中還發現了免疫細胞。根據基因表達水平對免疫細胞進行鑒定注釋。根據高表達基因和已發表的單細胞研究，確定了9個亞群。分別為NK細胞，巨噬細胞，單核細胞，T細胞，粒細胞巨噬細胞祖細胞（G-GMP），中性粒細胞，B細胞，漿細胞和粒細胞髓性抑制細胞（G-MDSC）。作者分析了退化等級與細胞群類型之間的相關性，相比輕度退化的NP組織，在嚴重退化的NP組織中G-MDSCs顯著減少。并且通過實驗，作者驗證了這一現象。這些結果顯示了G-MDSCs的存在對于IVDD的發展具有保護作用。

圖4 單細胞揭示免疫類細胞的細胞圖譜

圖5  G-MDSCs的功能研究

4. 構建以NPCs細胞為核心的細胞調控網絡模型
由于上述的分析結果顯示NP組織由NPCs和免疫細胞組成。接下來，作者通過細胞通訊分析，對細胞間的相互作用關系進行了預測，發現了免疫類細胞與NPCs類之間存在廣泛的作用關系。這些作用關系主要是通過細胞間的配體和受體進行，如VEGFA、VEGFB和VEGF受體（FLT1、ADRB2和NRP2等）。需要注意的是巨噬細胞和NPCs之間的相互作用關系可能與促進血管生成相關。而健康的IVD大部分是無血管的，顯示這種作用關系誘導的血管生成在IVDD的發展過程中扮有重要作用。除此之外，中性粒細胞和巨噬細胞表達生長因子，包括TGFβ、PDGF和OSM等，這些相關因子對于NPCs的增殖具有促進作用，這可能與NP內環境中的免疫平衡、細胞增殖和血管生成相關。然而確切的分子機制還需要進一步的實驗來驗證。

圖6  免疫細胞與NPCs在IVDD中的調控網絡

小編小結
作者通過單細胞轉錄組數據，分析了IVDD患者在退化過程中，NP組織中NPCs和免疫細胞的異質性和表型，以及這些細胞在IVDD發展過程中的作用。發現了幾種與IVDD發展密切相關的細胞類型以及對應的marker。并且通過細胞通訊分析構建了IVDD中的細胞相互作用關系的調控網絡，從而為IVDD治療提供了新的見解和線索。

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