腫瘤異質性是癌癥進展和治療抵抗的主要驅動因素之一。據推測，癌細胞亞群之間的合作對于維持異質性和促進腫瘤進展至關重要。然而，這種合作如何發生仍然難以捉摸。

細胞外囊泡（EVs）是細胞間通訊的中心介質。癌癥EVs具有很多功能，如促進癌癥相關成纖維細胞的分化，增強血管生成，調節抗腫瘤免疫應答，建立轉移前生態位并賦予非轉移性癌細胞轉移等特性。然而，具有不同表型和腫瘤形成能力的癌細胞亞群之間EVs的交換與交流的問題尚未得到解決。

2022年1月來自葡萄牙波爾圖大學的研究團隊在Gut（IF=23.059）上發表了題為“Extracellular Vesicles from Pancreatic Cancer Stem Cells Lead an Intratumor Communication Network (EVNet) to fuel tumour progression”的文章，首次揭示了由胰腺癌干細胞（CSC）細胞外囊泡領導的有組織的通信網絡，并展示了其在腫瘤生物學中的重要性。再通過蛋白質組學發現CSC中特異性表達的agrin，通過agrin/LRP-4/YAP通路影響腫瘤進展，并證明了agrin可作為胰腺癌治療干預的潛在新靶點，也可用于預測胰腺癌預后。

研究材料
人胰腺癌細胞；胰腺導管腺癌原位模型；患者衍生的異種移植物模型；基因工程小鼠模型；PDAC患者的血清樣本

技術路線
· 步驟1：構建熒光標記EVs的克隆，研究細胞亞群之間EVs的流動；
· 步驟2：改變微環境，研究EVNet的變化；
· 步驟3：構建動物模型，抑制EVs形成，研究破壞EVNet對腫瘤進展的影響；
· 步驟4：構建模型，比較CSC和NSCC分泌的EVs對腫瘤進展的影響；
· 步驟5：通過蛋白質組學研究CSC EVs影響腫瘤進展的原因；
· 步驟6：驗證agrin可作為胰腺癌治療的新靶點；
· 步驟7：發現并驗證循環agrin陽性EVs是疾病進展的預后標志物。

研究結果
1. 細胞外囊泡在癌細胞亞群之間自發流動
首先，研究人員在人胰腺癌細胞中建立了四種不同熒光標記EVs的穩定克隆，又基于細胞表面標志物的表達，從每種克隆中分別分選出一種特定的細胞亞群，兩種是以胰腺癌干細胞（CSC，與PADC的不良預后相關）為特征的罕見亞群，CD133⁺細胞和CD24⁺CD44⁺細胞；另外兩種是占據大多數的非干細胞（NSCC）亞群，CD24⁻CD44⁺細胞和4N (CD133⁻CD24⁻CD44⁻EpCAM⁻)細胞。將這四種細胞亞群混合培養，通過共聚焦成像分析研究EVs在細胞亞群之間的流動。研究發現，69.56%±11.92%的細胞對其他亞群的EVs呈陽性，表明癌癥EVs在它們之間自發流動，且流動方向以干細胞（CSC）到非干細胞（NSCC）為主，并排除了分泌的EVs數量、降解速率或細胞亞群的內吞能力的影響。綜上，胰腺癌細胞亞群通過細胞外囊泡的自發流動，構建了一個有組織的細胞間通訊網絡（EVNet）。

圖1 PDAC癌細胞亞群之間EVs的流動
 

2. EVNet有助于癌細胞適應微環境
接下來，研究人員探討了改變微環境的情況下EVNet是否受到影響。結果發現，缺氧使得細胞間的通訊頻率顯著增加，EVs流動方向仍以 （CSC）到（NSCC）為主。而化療引起EVs流動方向改變，非干細胞亞群之間的通訊頻率顯著增加。這表明EVNet是具有可塑性的，在面對微環境的挑戰時，會改變通訊速度甚至路線。
Rab27a參與細胞外囊泡的形成，敲除Rab27a后，細胞外囊泡分泌減少，缺氧和化療讓胰腺癌細胞死亡比例顯著升高。因此，細胞外囊泡通訊有助于癌細胞適應微環境變化。

圖2 微環境改變對EVNet的影響
 

3. 破壞EVNet會阻礙腫瘤生長
為了進一步研究EVNet的生物學作用，研究人員構建了Rab27a功能缺失型胰腺癌鼠模型，發現通過多四環素治療的小鼠腫瘤生長減緩，肝臟大轉移數量顯著減少，但組織學上沒有差異。接下來，用Rab27a的特異性小分子抑制劑Nexinhib20處理兩種動物模型（KPC、PDXs），來抑制EVs的分泌。結果顯示Nexinhib20處理后，KPC存活率顯著提高，PDXs腫瘤生長減緩。綜合表明Rab27a敲低會損害EVs介導的通訊，從而阻止癌癥的進展。

圖3 EVNet對腫瘤生長的影響
 

4. CSC分泌的 EVs是影響PDAC進展的原因
由于EVNet中最常見的通訊路徑是從CSC到NSCC，故特異性地去抑制CSC的EVs的通訊作用，從而研究其在生物學中的作用。首先從Rab27a敲低組和對照組中分別分離出CSC和NSCC細胞亞群，交叉混合后再原位移植到小鼠中，構建Rab27a敲低的CSC小鼠模型和NSCC小鼠模型。研究發現，Rab27a敲低的CSC小鼠模型中，多四環素喂養的小鼠腫瘤生長緩慢，重量顯著降低；而Rab27a敲低的NSCC小鼠模型中，無顯著變化。表明敲低CSC中的Rab27a，抑制其通訊能力，才是影響腫瘤生長的原因。

圖4 CSC和NSCC通訊功能差異比較
 

5. CSC EVs具有獨特的蛋白質組成并且富含agrin，促進腫瘤進展
為了找到CSC EVs如此特別的原因，研究人員采用labelfree蛋白質組學對四種人PDAC細胞系的癌細胞亞群及其分泌的EVs分別進行檢測。通過一系列生物信息學比較分析細胞和外泌體，CSC和NSCC之間的蛋白表達及功能差異，發現CSC EVs和NSCC EVs的蛋白質組成有非常大的差異，僅在CSC EVs中檢測到的大量蛋白質與PDAC發生發展過程密切相關，例如軸突導向通路，其中agrin是最富集的蛋白質之一。
在肝癌中，agrin通過與LRP-4受體結合激活YAP轉錄因子來促進肝癌發生。研究人員在胰腺癌細胞中也驗證了此通路的存在，證明了CSC EVs中的agrin促進YAP活化，促進癌細胞的增殖和存活率。

圖5 CSC和NSCC EVs蛋白質表達及功能比較
 

6. Agrin是PDAC中CSC的潛在治療靶點
上文已經證明了敲低Rab27a來抑制CSC中EVs的分泌可以抑制腫瘤生長，接下來，研究人員又試圖評估CSC EVs中特異性表達的agrin下調是否會對疾病進展產生影響。先從agrin敲低和對照組的細胞中分離出CSC和NSCC，再交叉混合移植到小鼠中，研究發現CSC中agrin下調會導致腫瘤生長減慢，腫瘤體積減小。在構建的agrin敲低的KPC模型（KPAC）中，與KPC小鼠相比，顯示出延遲的疾病進展，同時YAP表達顯著下調。以上實驗證明了agrin是胰腺癌治療干預的新靶點。

圖6 阻斷agrin的表達對疾病進展的影響
 

7. 循環agrin陽性EVs是疾病進展的預后標志物
最后，研究人員收集了44名胰腺癌患者的110例血液樣本，通過成像流式細胞術鑒定EV中agrin的表達，證明了cAGRN⁺EV的百分比與腫瘤負荷呈正比；其次發現了cAGRN⁺EVs和cCD133⁺EVs（來源于CSC）的百分比之間有顯著的相關性，進一步證明了cAGRN⁺EVs的來源；最重要的是，在沒有手術的患者中，cAGRN⁺EVs每增加1%，使疾病進展的風險增加2.94倍。
又通過受試者特征曲線（ROC）分析研究發現循環agrin陽性EVs可作為未接受手術的患者疾病進展的特異性和敏感性的生物標志物，與cCD133⁺EVs組合會提高預測疾病進展的準確性。

圖7 疾病進程中循環agrin陽性EVs的變化
 

小編小結
腫瘤是不同癌細胞亞群組成的復雜實體。癌細胞亞群之間會通過EVs進行通訊交流，且這種通信對于癌細胞克服微環境變化和茁壯成長至關重要。本文的工作表明，胰腺癌細胞亞群通過富含agrin的CSC EVs建立了一個有組織的，具有可塑性的通信網絡EVNet。同時發現了agrin可作為胰腺癌治療干預的潛在新靶點，并在PDAC臨床樣本中，證實了cAGRN⁺EV是疾病進展的預后生物標志物，具有深遠的臨床意義。

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