CRISPR-Cas9是一項可對基因組特定靶基因進行編輯的DNA操控技術，該系統由sgRNA和Cas9蛋白組成，Cas9蛋白在sgRNA的引導下對靶位點處的DNA雙鏈進行剪切，并產生一個平末端的雙鏈DNA缺口，進而啟動DNA損傷修復機制，通過非同源末端鏈接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組(Homologous recombination，HR）的方式將斷裂上下游兩端的序列連接起來。

目前，CRISPR-Cas9基因編輯技術在疾病基礎研究、靶點驗證、藥物分子的高通量篩選、以及遺傳性疾病的治療等領域得到了越來越廣泛的應用。sgRNA在CRISPR-Cas9基因編輯系統中具有準確識別靶基因序列的作用，其效果可影響編輯的效率、是否發生脫靶等，甚至對最終基因編輯的效果產生決定性作用。因此，設計合理有效的sgRNA是我們實現基因編輯的重要基礎。

sgRNA設計的一般流程如下：

圖1. sgRNA的設計流程

靶基因信息的分析
查詢靶基因信息常用的數據庫有NCBI、Ensembl等，在查詢過程中要注意物種的選擇和確定靶基因在數據庫中的登錄號，避免查找錯誤。查詢到目的基因信息后，需進一步關注其所在基因座上下游基因情況、轉錄本數量、外顯子數量及長度、翻譯起始位點與終止位點等信息。然后再綜合考量上述信息進行下一步的sgRNA設計。

此處以查詢人類Rag1基因為例。在NCBI Gene數據庫中輸入需要查找的人類Rag1基因，查找的結果顯示多個與Rag1相關的基因，這些基因包括了不同物種的Rag1同源基因。因而查找時需要注意該基因在NCBI的登錄號與種屬描述等（圖2a）。點擊查詢目的基因人類Rag1基因，顯示出該基因的基本信息。

可在“Download Datasets”下載該基因的相關序列。在“See related”可查看該基因在Ensembl數據庫中的相關信息，主要是為了查看該基因的轉錄本相關信息（圖2b）。鏈接到Ensembl數據庫后能查找到該基因的轉錄本數量等相關信息，此處顯示人類Rag1基因有三個轉錄本，并且可以打開任意一個轉錄本查看相關信息（圖2c）。查詢RAG1-201轉錄本信息，可打開左側“Exons”查看該轉錄本的外顯子等相關信息（圖2d），即可顯示該轉錄本的基本結構（圖2e）。
 

圖2. 靶基因信息的分析

靶區域的選擇原則
以基因敲除（KO）為例，基因敲除可采用2種不同策略——移碼突變和片段敲除，雖然不同的策略對于靶區域選擇的參考標準有差異，但也需遵循以下原則：

1. 不影響其他基因，尤其是編碼蛋白的基因。挑選靶區域時避免選擇與其他基因重疊的區域（圖3a）。
2. 盡可能影響所有的轉錄本，敲除位點最好在編碼區的前50%，但避免敲除ATG所在的位置（圖3b）
3. 能影響蛋白的功能結構域。

對于片段敲除，需考慮更多因素：如片段敲除所敲除的外顯子編碼序列之和為非3的倍數（圖3c），這樣可使靶區域后面的序列發生移碼，無法翻譯出功能蛋白，從而使敲除更徹底。片段敲除所選定的敲除區域不超過10Kb，超過10Kb后編輯效率會降低。片段敲除的gRNA設計在內含子上，這樣能敲除整個外顯子區，避免翻譯出殘留蛋白。并且gRNA的設計位點需靠近所敲除的外顯子，這樣可避免產生不可控的剪切信號而導致形成新的轉錄本。敲除區域前后序列盡量簡單，方便后續的PCR鑒定。
 

圖3. 靶區域選擇示意圖

（a）基因A與基因B共有一個外顯子（標藍的外顯子），因此選擇靶區域時應遵循不影響其他基因的原則，不以共有的外顯子作為靶區域。（b）存在多個轉錄本時，為了能敲除所有的轉錄本，應選擇在多個轉錄本均存在，且在編碼區的前50%的外顯子（此處選擇標紅的外顯子）作為靶區域。（c）片段敲除時，因基因片段過大不能全部敲除而選擇敲除部分外顯子，敲除片段的編碼序列之和應為非3的倍數，使后面的蛋白發生移碼突變。

gRNA的設計
目前有較多提供gRNA設計的在線工具，常用的如張鋒實驗的CRISPOR（http://crispor.tefor.net/），只需輸入目標序列，選定好種屬基因組與相應的PAM，則可以得出多個gRNA，以及每個gRNA對應的特異性、切割效率和潛在脫靶位點，一般選擇特異性、切割效率得分高的gRNA作后續實驗（圖4）。

如果需要手動設計gRNA，則需要考慮其特異性與切割效率。在靶點設計時要綜合考慮所有候選靶點的序列、位置、正負鏈、GC含量、潛在的脫靶位點等信息。
 

圖4. CRISPOR在線網頁設計sgRNA流程

脫靶分析
根據選擇的sgRNA，通過生物信息學方法，對sgRNA進行脫靶分析。推薦使用CCTop（https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/）在線網頁進行預測。將sgRNA序列輸入，選定相應種屬基因組進行分析（圖5）。并且對獲得的遺傳材料進行檢測。挑選前10個潛在脫靶位點，通過PCR測序驗證是否脫靶。如果實驗要求較為嚴格的，則需要通過全基因組測序鑒定脫靶情況。
 

圖5. sgRNA在CCTop在線網頁的脫靶分析

sgRNA的設計，你學廢了嗎？不過這僅僅是基因編輯方案設計中的一環，基因編輯方案還需要考慮目的基因轉錄本分析、轉染方法、細胞克隆形成能力等多種因素，即使一位非常熟練的方案設計專家出一份方案都需要幾個小時或更長，且疏漏也在所難免。