石蠟切片免疫組化染色步驟

1、載玻片的處理：
抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗(yàn)的正常進(jìn)行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip^TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對(duì)已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：
1.1 APES：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時(shí)應(yīng)注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。

1.2 Histogrip^TM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60^oC烤箱烘烤一小時(shí)，裝盒備用。

1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60^oC烤箱烘烤一小時(shí)或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。

2、常用酶消化：
2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時(shí)間為37℃、10~40分鐘，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。

2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時(shí)間為37℃、30~180分鐘，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。

2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10mg/ml的saponin溶液，消化時(shí)間為室溫孵育30分鐘。

3、抗原熱修復(fù)：
可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)。抗原熱修復(fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請(qǐng)選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請(qǐng)自行調(diào)整。

3.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，3％H₂O₂處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請(qǐng)根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對(duì)溫度和時(shí)間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

3.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)（約加熱5~6分鐘后），計(jì)時(shí)1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計(jì)時(shí)15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

4、免疫組化染色步驟：
（以美國ZYMED公司SP試劑盒為例）
4.1石蠟切片脫蠟至水。
4.2 3%H₂O₂室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
4.3蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，(如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行)。
4.4 5~10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過夜。
4.5 PBS沖洗，5分鐘×3次。
4.6滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。
4.7 PBS沖洗，5分鐘×3次。
4.8滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。
4.9 PBS沖洗，5分鐘×3次。
4.10顯色劑顯色（DAB或AEC）。
4.11自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。

冰凍切片免疫組化染色步驟
冰凍切片4~8mm，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2。
下接免疫組化染色操作步驟。