免疫組織化學（IHC）是確定組織切片上蛋白的存在與否及存在位置的一種方法。盡管這種方法在定量分析時靈敏度較免疫印跡法或ELISA等免疫測定方法低，但是它能觀察到整個組織的情況，同時可以檢測目的蛋白在組織中的表達位置。適用于評估癌癥等疾病的發(fā)展及治療情況。因此，從IHC獲得的信息結(jié)合顯微技術(shù)給廣大科研工作者提供了一幅“宏圖”，使來自其它方法的數(shù)據(jù)有據(jù)可依。

免疫細胞化學（ICC）技術(shù)則是IHC技術(shù)在細胞樣本中的應用，通過對懸浮/爬片細胞進行免疫染色，可以檢測到目標蛋白在細胞中的表達位置和含量等信息，更加直觀。

IHC和ICC染色是抗體識別靶抗原的過程。因為抗體與抗原的結(jié)合是高度特異的，因此，它只與組織切片或細胞樣本中相應的蛋白結(jié)合。應用顯色檢測法即能看到抗原—抗體反應，其顯色方法是將使用酶結(jié)合的抗體，在添加底物后，通過酶促反應在蛋白位點產(chǎn)生色素沉著。另外一種方法是直接使用熒光染料標記的抗體，將抗體識別與熒光顯色技術(shù)相結(jié)合，通過熒光顯微技術(shù)對樣本進行檢測，這種方法通常被叫做免疫熒光（IF）。結(jié)合目前先進的熒光顯微鏡成像技術(shù)，如激光共聚焦顯微鏡，IF可以得到檢測樣本的三維立體結(jié)構(gòu)，更加形象直觀。

要實現(xiàn)可靠一致的實驗結(jié)果，對操作流程的優(yōu)化必不可少。IHC/ICC/IF的原理和實驗步驟大體相同，整體實驗流程如下圖所示。

免疫染色實驗流程圖

二．設(shè)計實驗  
 
1.實驗對照

實驗對照：在進行免疫組化染色時，必須證實組織內(nèi)顯示的反應產(chǎn)物，確實是抗原與相應的特異性抗體反應所產(chǎn)生的。由于免疫組織化學染色中影響抗原、抗體和免疫反應的因素很多，因此對免疫組織化學染色結(jié)果的評價必須設(shè)置對照組才能做出正確的判斷。常用的對照組有以下幾種：

陽性對照：用已證實含用待測抗原的組織，與待檢標本做同樣處理后，進行免疫組化染色，結(jié)果應為陽性，稱為陽性對照。每次實驗都應做陽性對照，通過陽性對照可證明靶抗原有一定活性，染色過程中各個步驟以及所用的試劑都合乎標準，染色方法可靠。特別是當待檢的標本為陰性結(jié)果時，陽性對照呈陽性反應，可排除待檢標本假陽性的可能。所以若預期染色結(jié)果是陰性時，就必須設(shè)陽性對照。

陰性對照：用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結(jié)果為陰性。陰性對照可證實組織內(nèi)若不含靶抗原，就不應染色，可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應等因素造成的“假陽性”結(jié)果。

空白對照：是最常用的對照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結(jié)果應為陰性，說明染色方法可靠，可排除組織的內(nèi)源性過氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質(zhì)引起的非特異性顯色。

替代對照：用與第一抗體來源的同一動物免疫前血清，如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對照中用非免疫性的正常IgG血清來替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進行對照染色。這可證明待檢切片中陽性結(jié)果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細胞內(nèi)待檢抗原的特異性反應的結(jié)果。但使用的商品抗體往往不能用同一種動物的免疫前血清做替代對照，也可用未經(jīng)免疫的同種動物血清，即非免疫血清替代一抗。

吸收試驗對照：用過量已知相應的純化抗原與第一抗體反應，抗體結(jié)合點全部被抗原結(jié)合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內(nèi)的抗原反應，故再做免疫組化染色時，結(jié)果應為陰性。

自身對照：用同一組織切片上與待檢抗原無關(guān)的其它結(jié)構(gòu)做對照。陰性反應與陰性結(jié)構(gòu)同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應的特異性對照。但進行科研工作中，單純用這種對照是不科學的。必須增加如空白對照、替代對照等，才能使染色結(jié)果得到承認�，F(xiàn)代國際上發(fā)表文章，一般在免疫組化染色的同時，還須有Western blotting做相應蛋白質(zhì)檢測的實驗結(jié)果加以證實。

好的開始是成功的一半，在實驗中尤其如此。一個好的實驗設(shè)計往往決定了實驗的成敗。在正式試驗開始前，最好設(shè)立一項小規(guī)模的預實驗，可以確定某個抗體（尤其是新抗體）的最佳使用條件。可以借助此小型預實驗，解決操作流程中關(guān)鍵步驟的潛在問題，然后再開展規(guī)模較大的實驗，這樣不僅節(jié)省時間，還能減少試劑消耗。

一抗是免疫學實驗的關(guān)鍵成分，其性能可直接影響到數(shù)據(jù)量。能用于免疫印跡法（WB）檢測特異性條帶的抗體無法充分保證適用于IHC/ICC/IF等實驗。這是因為WB分析將蛋白置于容易導致還原/變性的惡劣條件中，使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（失去3D結(jié)構(gòu)，變?yōu)榫�性形式）。經(jīng)驗證可用于WB的抗體識別表位，在IHC/ICC/IF實驗中，因為蛋白維持其天然狀態(tài)，則可能會被隱藏和/或被掩蓋。