在哺乳動物胚胎發育的過程中，多能細胞迅速分裂分化，但是每個器官細胞譜系的調控程序仍不清楚。近日，中科院動物研究所劉峰課題組與劍橋大學、加州大學圣地亞哥分校的研究人員在《Nature Cell Biology》雜志上合作發表了題為“Single-cell chromatin accessibility maps reveal regulatory programs driving early mouse organogenesis”的文章，利用單細胞染色質圖譜分析技術，對哺乳動物器官發育的分子調控機制有了新的認識。

E8.25小鼠胚胎的單核染色質圖譜

對于小鼠而言，8天左右的胚胎日齡是細胞類型多樣化的關鍵時期，因為大多數主要器官的前體細胞已經形成。不過，由于早期胚胎中的細胞數量很有限，也缺乏標志物蛋白來區分各種細胞，人們很難對其進行分析。近期出現的單細胞分子圖譜繪制技術，終于讓人們有機會對早期器官發生時的細胞復雜性有了全面的認識。

在這項研究中，研究人員首先利用單核ATAC-seq技術，繪制了來自10個小鼠胚胎（E8.25）的19,453個單細胞核的染色質開放性圖譜（圖1a）。他們合并所有數據并進行peak calling，以此來定義開放的染色質區域（OCR），并將峰的列表與已知的轉錄起始位點（TSS）合并來鑒定稀有的細胞群。

通過這種方式，他們生成了18個細胞群，覆蓋三個胚層和胚胎外組織（圖1b）。為了進一步評估數據質量，他們研究了α-珠蛋白基因簇，該簇由胚胎（Hba-x）和成體（Hba-a1和Hba-a2）珠蛋白基因組成，其上游增強子（R1–R4和Rm）的特征明確。他們發現，僅紅系細胞簇的增強子可開放（圖1c），也只有胚胎Hba-x基因處于開放染色質中，與成體基因形成鮮明對比。

圖1. 早期小鼠器官發生的單細胞染色質圖譜

細胞特異性的染色質圖譜

接下來，研究人員定義了細胞類型特異性的染色質，用于鑒定常見的生物學過程。他們以19,453個細胞核作為變量，利用其開放性差異來觀察305,187個基因組區域。圖譜顯示了細胞特異性的開放染色質區域在不同部位的分離（圖2a）。

同時他們還發現，相同胚層特有的開放染色質區域是相鄰的，而神經中胚層前體細胞（NMP）的開放染色質區域位于脊髓和體壁中胚層之間，因此反映了發育譜系的關系。細胞特異性的開放染色質區域主要位于基因間和內含子，而那些普遍存在的區域（在超過25%的細胞核中存在）則大多與啟動子重合（圖2b）。

圖2. 細胞特異性的染色質圖譜

兩個TAL1結合的內皮增強子

成長中的小鼠胚胎嚴重依賴于早期循環系統的建立，以獲得充足的氧氣。血液和內皮的發育通過共同的前體細胞、標記基因、調控信號和蛋白密切關聯。在早期的小鼠胚胎中，第一波的原始血細胞大概是在E7.5從中胚層前體中產生的，瞬時表達與內皮相關的基因。隨后，在E8.25左右，第二波得原始血細胞是從形成的內皮細胞中產生。

為了評估一些內皮細胞如何向血液轉化，而其他內皮細胞如何從尿囊中產生，研究人員重新評估了標注為尿囊、紅系和內皮的開放性圖譜。通過UMAP分析，他們觀察到一系列內皮細胞向血液轉化，表明它們具有造血性質。同時，他們還檢測到一組可能從尿囊中轉化而來的內皮細胞，與之前發表的文獻一致。

鑒于轉錄調控因子TAL1能破壞first and second blood waves，研究人員接著探索了TAL1結合與染色質開放性有何關聯。通過數據分析，他們不僅鑒定出先前發現的內皮增強子Erg+85 kb和Fli1−15 kb，還發現了位于Flt1和Maml3基因的候選增強子（分別為Flt1+67 kb和Maml3+360 kb）（圖3）。轉基因小鼠胚胎（由賽業生物提供）實驗表明，E11.5小鼠脈管系統中的兩種候選增強子均具有活性，這也顯示了細胞特異性的染色質圖譜有助于鑒定組織特異性的調控區域。

圖3. Flt1+67 kb和Maml3+360 kb是兩個內皮特異性的增強子

Fev參與了血管內皮細胞的形成

正如前文所述，尿囊細胞可以在E8.25轉化成內皮細胞。于是，研究人員便利用這種分化過程來研究胚胎發育過程中與內皮細胞建立相關的調控程序。他們發現，ETS轉錄因子Fev和Etv2聚集在一起，在每個軌跡的中間都有一個特定的表達峰，表明它在胚胎內皮的建立過程中發揮潛在作用。

于是，他們在斑馬魚中開展了體內研究。他們將fev mRNA注入1-2個細胞階段的斑馬魚野生型胚胎中以評估fev過表達的作用。他們發現，這導致斑馬魚10體節期（10s）的lmo2和tal1上調以及受精后26小時（26 hpf）的內皮細胞標志物flk1上調，而原始造血標志物gata1a沒有上調，這支持了fev在賦予內皮特性上的作用。之后的一系列分析也表明，fev為血管內皮細胞發育最初階段的調控因子。

作者認為，在小鼠和斑馬魚中開展的體內驗證實驗結果一致，表明單細胞開放染色質圖譜有助于人們了解哺乳動物器官發生中的調控機制，這對于干細胞研究和醫學領域具有重要意義。

原文檢索：

Pijuan-Sala, B., Wilson, N.K., Xia, J. et al. Single-cell chromatin accessibility maps reveal regulatory programs driving early mouse organogenesis. Nat Cell Biol 22, 487–497 (2020).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41556-020-0489-9.