現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組研究平臺是基于冰凍樣本進行研究，所以在樣本凍存前至少10分鐘，將異戊烷和液氮浴準(zhǔn)備好（之所以用異戊烷而不直接用液氮進行速凍，是因為液氮沸點比較低，直接液氮處理可能在沸騰過程中使組織周圍形成空穴，導(dǎo)致不同區(qū)域降溫不同步而改變內(nèi)部形態(tài)，甚至組織碎裂）。然后用鑷子或者刮刀將新鮮組織轉(zhuǎn)移到異戊烷中，使組織完全浸沒且浸泡至少1分鐘。冷凍后，可用鑷子或者刮刀將組織轉(zhuǎn)移到密封的預(yù)冷容器或者凍存管中，-80℃儲存，或者進行OCT包埋。

1.組織樣本選擇

空間轉(zhuǎn)錄組研究的特點是基于空間物理位置的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，所以組織樣本的選擇是該研究的前提條件。由于空間轉(zhuǎn)錄組捕獲芯片的限制（6.5mmX6.5mm），組織樣本最后上芯片的切片不能超過該面積范圍。因此，在選擇實驗樣本前，需要對進行研究的樣本進行預(yù)實驗。通過前期組織學(xué)檢測，確認好樣本的最佳取材位置，最合理組織大小。如果本身樣本使較大的組織，可以在后續(xù)OCT包埋、切片過程中被分割（1mm切口的預(yù)冷刀片），避免深切口損傷組織。

2.新鮮樣本處理

空間轉(zhuǎn)錄組是針對轉(zhuǎn)錄組學(xué)的檢測，因此，新鮮樣本是保證RNA完整性的前提（后續(xù)RNA RIN值＞7）。將新鮮組織樣本取下后迅速用預(yù)冷的PBC溶液或者生理鹽水沖洗組織表面殘留，然后用干凈的紗布或吸水紙吸干液體（防止其他體液在組織表面形成冰晶，影響OCT包埋效果）。

圖1 組織冷凍與包埋過程

3.樣本凍存

現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組研究平臺是基于冰凍樣本進行研究，所以在樣本凍存前至少10分鐘，將異戊烷和液氮浴準(zhǔn)備好（之所以用異戊烷而不直接用液氮進行速凍，是因為液氮沸點比較低，直接液氮處理可能在沸騰過程中使組織周圍形成空穴，導(dǎo)致不同區(qū)域降溫不同步而改變內(nèi)部形態(tài)，甚至組織碎裂）。然后用鑷子或者刮刀將新鮮組織轉(zhuǎn)移到異戊烷中，使組織完全浸沒且侵泡至少1分鐘。冷凍后，可用鑷子或者刮刀將組織轉(zhuǎn)移到密封的預(yù)冷容器或者凍存管中，-80℃儲存，或者進行OCT包埋。

4.OCT包埋

OCT包埋是用來為后續(xù)切片制作做準(zhǔn)備。將預(yù)冷好的OCT填充入冷凍模具的底部（可做好標(biāo)記，以確認組織方向），然后用鑷子迅速將冰凍好的組織放入，并用OCT覆蓋組織，使之完全包埋住。該過程應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。然后立即將冷凍磨具轉(zhuǎn)移到碎干冰上。當(dāng)OCT變得完全不透明，包埋成功。當(dāng)然，作為強迫癥的你，也可以對組織進行修理，去掉多余部分，留下需要的組織塊。最后，包埋好的組織塊可進行干冰上運輸至-80°C進行儲存。

圖2 OCT包埋前后

5.切片制備

如果老師做好冰凍組織包埋工作了，如果沒有后續(xù)切片設(shè)備進行切片制備，可以直接將樣本給我們，我們來進行后續(xù)的工作及空間轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灐Ｈ绻麑嶒炇矣性O(shè)備，可自行進行切片制備及相關(guān)組織學(xué)檢測。以現(xiàn)有研究測試樣本情況來看，大部分的樣本切片厚度保持在10-20um之間為宜。另外，制備好的冰凍切片盡量在一周內(nèi)送至公司進行后續(xù)實驗。我們會取OCT包埋樣本的10張切片，用核酸試劑盒抽提RNA并通過RIN評估制備樣本的質(zhì)量；RIN>7的樣本，建議做下游組織優(yōu)化的實驗。



以上5個實驗步驟為空間轉(zhuǎn)錄組測序檢測前的樣本準(zhǔn)備過程，您也可以在進行空間轉(zhuǎn)錄組測序前，提前與我們進行溝通，上海生物芯片可提供一體化空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。