2013年，一種名為的“CRISPR”的基因編輯技術出現后，“基因編輯”這個詞匯不經意間火了，傳遍了整個學術圈、生活圈，甚至是朋友圈。它的出現讓“編輯生命”變得觸手可及，它似乎可以斗過癌癥（白血病）和艾滋病，還有各種遺傳病。

我們知道，目前這些人類疾病都沒有辦法從根本上治療，而它們幾乎都和基因突變相關。基因編輯的出現為我們人類健康帶來巨大的福音，與此同時，基因編輯的小鼠日漸成為不可忽視的大明星，為人類疾病臨床前研究作出了不可估量的貢獻。本期的內容就是一起看看基因編輯小鼠如何一步步成長并成為我們必不可少的研究工具。

一、基因編輯小鼠定義

基因編輯小鼠：利用基因編輯的方法改變小鼠目的基因片段，實現對特定基因片段進行敲除，引入突變或外源基因等，從而獲得基因修飾的小鼠，主要分為基因敲除（KO）、基因敲入(KI)、條件性敲除小鼠(CKO)等。

二、基因編輯小鼠重大意義

由于疾病包括癌癥、罕見病（β-地中海貧血、肌肉萎縮癥等）都與基因突變有關，基因編輯構建的疾病模型已經成為現代生命科學基礎研究和藥物研發領域不可或缺的工具。

1.基因功能研究

基因編輯的小鼠，被廣泛應用于研究基因在小鼠中的功能，由于小鼠與人有90%同源基因，因此這些基因功能可以類推至人類身上。比如對于P53基因敲除鼠的研究讓我們確認了這一著名的抑癌基因的功能。

2.疾病機理研究

利用基因編輯在小鼠身上模擬人類疾病，是一條研究疾病機制的捷徑。苯丙尿酮癥是一種苯丙氨酸代謝障礙導致的常染色體隱性遺傳病，有較高發病率，且對患兒有極大傷害。在PAH基因第12外顯子敲除2bp（PAH^416STOP）或將PAH蛋白序列408位精氨酸替換為色氨酸（PAH^R408W）可以構建典型的苯丙尿酮癥小鼠，多用于發病機制與治療手段的研究。如下圖為敲除鼠毛色減退，并且血苯丙氨酸含量高于野生型小鼠。

 

3.藥物研發的重要工具

通過基因改造使基因敲除或添加的小鼠，成為癌癥、動脈粥樣硬化、骨關節炎、肌肉萎縮癥和帕金森氏癥等一系列人類疾病的關鍵研究模型。我們利用基因修飾的疾病模型，開發藥物或者采用基因編輯技術修復突變基因，從而治愈疾病成為可能。2016年劉明耀教授課題組就利用CRISPR/Cas9技術治愈了F9突變小鼠的B型血友病。

三、基因編輯技術小鼠變得日益簡單

自首個轉基因小鼠在1974年由Rudolf Jaenisch培育出后，Jackson Lab和其他實驗室一直在致力于基因小鼠的構建，然而其步驟繁瑣，辛苦費力，涉及利用基因工程技術改變小鼠的胚胎干細胞，將其注射進胚胎，并且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的團隊，也要用2年時間才能成功改造一只小鼠。而CRISPR的出現，顛覆了所有的一切，它能在6個月內就產生基因修飾的的小鼠。

基因編輯技術小鼠發展歷程

1.ES基因打靶技術

出現時間：1987年，Capecchi和Smithies根據染色體同源重組的原理，在小鼠胚胎干細胞（mES）水平首次實現了外源基因的定點整合，這就是廣為人知的ES基因打靶技術。

原理：利用基因打靶獲得的陽性ES細胞再經過胚胎顯微注射，最終就可以得到基因敲除/敲入小鼠。

優勢：作為早期的基因編輯技術，克服了隨機整合的盲目性和危險性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法。尤其是條件性、可誘導性基因打靶系統的建立，使得對基因靶位點在時間和空間上的調控更加精確。

缺點：基因打靶依賴于DNA同源重組修復機制，效率非常低（1/10⁶）；并且通過ES基因打靶獲得目的基因修飾的小鼠周期很長。

2.人工鋅指核酸酶—ZFN

出現時間：1996年，Kim等人利用鋅指蛋白融合FokI核算內切酶，成功構建了人工鋅指核酸酶(zinc Finger Nucleases，ZFNs)。

原理：如下圖，ZFN的DNA識別域由3至4個Cys2-His2鋅指蛋白串聯組成，每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的三聯體堿基。當DNA識別域特異結合到目的基因時，核酸內切酶就能夠切割目標DNA序列。

優點：同傳統的打靶技術相比較，其效率提高了100倍以上。同時，可通過受精卵顯微注射直接獲得基因修飾小鼠，節省了大量時間。

缺點：費用高昂，工作量大，并且最終產生的ZFNs會產生細胞毒性。

3.轉錄激活因子樣效應物核酸酶-TALEN

出現時間：2011年科學家首次把TALE 與FokI 結合在一起組成轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs),并證實了TALEN能夠對目標基因進行切割。

原理：如下圖，TAL效應子可被設計識別和結合所有的目的DNA序列。對TAL效應子附加一個核酸酶就生成了TALENs。TAL效應核酸酶可與DNA結合并在特異位點對DNA鏈進行切割，從而導入新的遺傳物質。

 

優點：相比于ZFNs，TALEN的獲取更加簡單方便，花費較低，細胞毒性相對ZFNs較低，因此自出現起就獲得了廣泛應用。

缺點：依然有一定的細胞毒性，且模塊組裝過程復雜繁瑣，難以實現多基因和多位點的修飾。

4.規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)

出現時間：CRISPR/Cas9系統是細菌或古生菌防御外源核酸（如噬菌體和質粒DNA）入侵的一套防御機制，于2013年被發現應用于基因組修飾。

原理：如下圖，通過設計向導RNA(Guide RNA,gRNA) 序列并將Cas9蛋白引導到基因組的特定位點上，然后通過Cas9 的核酸酶切割活性造成DNA 斷裂。

 

優勢：被喻為“魔術剪刀”，可以高效定點的實現基因編輯。相比于ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9技術具有二者無法比擬的可操作性，構建時間成本大大降低，并且簡便高效的特點極大地推動了生命醫學領域的研究，并為根治諸多遺傳疾病帶來了新的希望。

近年來，隨著CRISPR/Cas9技術的出現，使基因編輯小鼠似乎變得唾手可得，構建一只基因編輯小鼠僅需要4-6個月。因此，越來越多的高分文章開始采用該小鼠模型進行相關疾病和基因功能的研究。

所以說，目前不僅僅是牛人開始談論起基因編輯小鼠，身邊的同學們也紛紛涌入這類小鼠的研究。所以，想想你的課題需要構建此類疾病模型嗎，需要研究某個基因功能嗎？如果需要，那就趕緊擼起袖子干吧，因為一切已變得前所未有的簡單！

參考文獻

1.Thomas KR, Capecchi MR.Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 1987;51(3):503-12.

2.Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S.Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(3):1156-60.

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