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增強型RIPA裂解液使用說明書

瀏覽次數:7261 發布日期:2019-6-24  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

對于細胞:

注意:取適當量的裂解液,放與4℃預冷,使用前數分鐘內需加入酶抑制劑。

1.  貼壁細胞,細胞刮刮下細胞,計數,并收集5×106 個細胞,600g 離心5分鐘,盡量吸盡上清,用預冷的PBS重懸細胞,600g 離心5分鐘收集細胞,盡量吸盡上清,加入0.5ml的預冷的裂解液,用移液器吹打數下,冰上孵育30分鐘, 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。

注意:可以直接將裂解液加入培養細胞的器皿中裂解細胞,具體操作如下,

A.用移液槍小心吸去培養液,

B.加入適量的預冷的PBS,

C.用移液槍小心吸去PBS,

D.按照下表加入裂解液,冰上孵育30分鐘。

E.將裂解液轉入離心管中, 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。

板規格/表面積

試劑用量

100mm                      

500~1000ul

60mm

250~500ul

6-well   plate

200~400ul   per well

24-well   plate

100~200ul   per well

96-well   plate 

50~100ul   per well


2.懸浮細胞,計數,并收集5×106 個細胞,600g 離心5分鐘,盡量吸盡上清,用預冷的PBS重懸細胞,600g 離心5分鐘收集細胞,盡量吸盡上清,加入0.5ml的預冷的裂解液,用移液器吹打數下,冰上孵育30分鐘, 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。

對于組織:

注意:取適當量的裂解液,放與4℃預冷,使用前數分鐘內需加入酶抑制劑。

1. 手術切除的組織塊迅速置于預冷的生理鹽水中,漂洗數次,洗凈組織血跡,用濾紙吸干組織表面液體,將組織切成幾個較小的組織塊。

2. 稱量組織,按組織凈重(g):裂解液(ml)=1:10的比例,加入相應體積的裂解液進行勻漿 ,(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量)。

3. 勻漿器勻漿,肉眼觀察無明顯組織塊,冰上孵育30分鐘。

4. 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。

 

結果實例:    

   M        N                M         N                 M         N     

1-1.png   2-2.jpg   3-4.png

          DSG3                     HSP90                      PCNA

M:Hela Cells  N:A549 Cells

如圖:增強型RIPA裂解液提取細胞蛋白,BCA測定蛋白濃度,上樣20ug,電泳,轉膜,孵育博士德一抗,應用博士德ECL發光液顯色。

故障排除:

問題

原因

解決辦法

總蛋白量低

有些細胞較難裂解

確保細胞沉淀完全懸浮在增強型RIPA緩沖液中并孵化更長的時間,超聲波處理以增加產量

蛋白濃度低

裂解液用量多

減少裂解液的用量

蛋白水解

沒有加入蛋白酶抑制劑

加入蛋白酶抑制劑

磷酸化蛋白量少

磷酸酶活性高

加入磷酸酶抑制劑

發布者:上海一基實業有限公司二部
聯系電話:021-60548336
E-mail:2851717387@qq.com

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