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肝癌模型Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)和常見問題解答

瀏覽次數(shù):50 發(fā)布日期:2025-7-14  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
【細(xì)胞介紹】

Hep G2 [HEPG2] 是一種表現(xiàn)出上皮樣形態(tài)的細(xì)胞系,是從一名患有肝癌的阿根廷 15 歲白人男性青年的肝細(xì)胞癌中分離出來的。該細(xì)胞分泌多種血漿蛋白:清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細(xì)胞系由Wistar研究所獲得,是合適的轉(zhuǎn)染宿主。表達(dá)標(biāo)志物包括胰島素;胰島素樣生長因子 II (IGF II)。

Hep G2細(xì)胞生長特性‌通常緊密連接成片狀增殖,初期附著于培養(yǎng)瓶壁形成小島狀結(jié)構(gòu),后期可能出現(xiàn)多層堆積或懸浮狀態(tài)。該細(xì)胞系因貼壁性強(qiáng),常用于研究肝細(xì)胞功能及病毒模型。以下是中喬新舟拍攝的Hep G2細(xì)胞拍攝的在不同放大倍數(shù)下的圖片:
  

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細(xì)胞名稱:Hep G2人肝癌細(xì)胞
細(xì)胞別名:HEP-G2; Hep G2; HEP G2; Hep-G2; HEPG2
產(chǎn)品貨號(hào):ZQ0022
生長特性:貼壁生長
培養(yǎng)條件:87%MEM(含NEAA)(貨號(hào):ZQ-300)+10%進(jìn)口胎牛血清(貨號(hào):ZQ500-S)+1% L-alanyl-L-glutamine(貨號(hào):CSP004)+1%丙酮酸鈉(貨號(hào):CSP003)+1%雙抗(貨號(hào):CSP006)
含血清完全培養(yǎng)基貨號(hào):ZM0022
無血清完全培養(yǎng)基貨號(hào):SFM0022
培養(yǎng)環(huán)境:95%空氣,5%二氧化碳;37℃
 
【傳代培養(yǎng)】

該細(xì)胞為貼壁生長:
1、細(xì)胞有脫落情況時(shí),將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中,離心(125g,3~5分鐘)1000-1200rmp收集懸浮細(xì)胞(漂浮細(xì)胞少,可能無沉淀,大部分在管壁上);輕柔去除培養(yǎng)基,等貼壁細(xì)胞消化收集在一起混勻接種。
2、貼壁細(xì)胞用PBS洗1~2次,每次3-5ml,添加1ml 胰酶(0.25% 含EDTA)到細(xì)胞瓶中,輕輕搖勻,使胰酶溶液鋪滿細(xì)胞表面,放入培養(yǎng)箱中。1-3min后取出到顯微鏡下觀察,(若細(xì)胞無變化繼續(xù)放入培養(yǎng)箱消化)一旦細(xì)胞變圓、輕拍瓶尾部大部分細(xì)胞開始脫落,當(dāng)達(dá)到70-80%細(xì)胞漂浮脫落,立即加入5ml完全培養(yǎng)基(含10%FBS)中和。用移液管輕輕吹打6-8次,使細(xì)胞充分解離。
3、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中,計(jì)數(shù),離心收集細(xì)胞。用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀,使細(xì)胞密度為每毫升0.6-2X105。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中,靜置于培養(yǎng)箱中。建議T25培養(yǎng)瓶添加5-7ml完全培養(yǎng)基,以后2-3天進(jìn)行換液。
 
【細(xì)胞凍存】

1、細(xì)胞密度80%以上,活細(xì)胞百分率達(dá)95%以上時(shí),將細(xì)胞按照以上步驟進(jìn)行消化收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行凍存。
2、細(xì)胞沉淀用適量4°C凍存液(貨號(hào):CSP042)重懸, 建議一瓶T25細(xì)胞凍存一管(1ml/管),直接將分裝好的細(xì)胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜,若需液氮長期保存,需先置于-80℃至少一天后方可轉(zhuǎn)至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請(qǐng)按照凍存液說明書操作,若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃,放置 40min:-20℃,放置 30min-60min,-80℃放置一天后轉(zhuǎn)移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后,再轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
 
【細(xì)胞復(fù)蘇】

1、液氮取出的細(xì)胞放入干冰中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房,提前準(zhǔn)備好完全培養(yǎng)基,離心管等試劑和耗材。
2、凍管細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍(大約1-2分鐘)。為了減少污染的可能性,保持凍管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內(nèi)容物解凍,立即將凍管移出水浴,70%的乙醇消毒凍管外壁。
3、將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含3-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中,輕輕混勻,離心(125 g,3~5分鐘)1000-1200rmp去除培養(yǎng)基, 管底細(xì)胞沉淀用手指彈松,再添加3ml完全培養(yǎng)基至離心管內(nèi)混勻細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。
4、用適量完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至0.6-2.0X105,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,再將瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。T25培養(yǎng)瓶建議添加5-7ml完全培養(yǎng)基。當(dāng)密度達(dá)到80%以上時(shí)傳代。

【常見問題】

1、培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?
1)細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2.)細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化,混勻細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞,再離心后,用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時(shí)碎片比較少,傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。

2、空泡現(xiàn)象
HepG2細(xì)胞中常有空泡,這是該細(xì)胞正常特性,不影響細(xì)胞生長,無需擔(dān)心。

3、細(xì)胞生長慢
培養(yǎng)條件適宜的情況下,在T25培養(yǎng)瓶中生長的HepG2細(xì)胞,以1:2傳代后,培養(yǎng)2-3天可以到達(dá)80%匯合率。若細(xì)胞生長過慢甚至不生長,可將血清增加至15%-20%(不要超過20%),待細(xì)胞恢復(fù)生長速度后再將血清比例降低到10%。
細(xì)胞接種密度不可過低,否則生長非常緩慢。

4、細(xì)胞聚團(tuán)或不貼壁
血清品牌和培養(yǎng)基pH是影響HepG2細(xì)胞貼壁性的關(guān)鍵因素。
通常HepG2細(xì)胞呈單層生長,但遇到不合適的血清細(xì)胞可能呈現(xiàn)聚集傾向,最終聚團(tuán)且不易消化開;也可能貼壁性變?nèi)酰〖?xì)胞變多。使用高質(zhì)量低內(nèi)毒素未滅活的胎牛血清,可以幫助細(xì)胞更好地貼壁及形成單層細(xì)胞。
pH過高過低都將影響細(xì)胞貼壁性,每天觀察培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)基的顏色,偏黃及時(shí)換液,偏紫時(shí)檢查培養(yǎng)箱CO2供應(yīng)是否正常,培養(yǎng)瓶是否透氣,并及時(shí)換液。

5、漂浮細(xì)胞多
排除上文中提到的血清和pH對(duì)細(xì)胞貼壁的影響,傳代或復(fù)蘇后若有部分細(xì)胞漂浮,是正常現(xiàn)象,隨著培養(yǎng)部分漂浮細(xì)胞會(huì)逐漸貼壁。漂浮細(xì)胞較多時(shí)不要扔,使用臺(tái)盼藍(lán)檢查細(xì)胞活性,若大部分是活細(xì)胞,將這些細(xì)胞離心收集后重新接種至原瓶。增加血清量(總比例不超過20%)可以促進(jìn)貼壁。
消化時(shí)需注意時(shí)間不能太長,第一次消化該細(xì)胞要摸索最佳時(shí)間。中和時(shí)輕柔吹打,控制吹打次數(shù)和力度,可有效減少傳代后漂浮細(xì)胞。

6、有圓形細(xì)胞粘附在貼壁的單層細(xì)胞上
這在HepG2培養(yǎng)時(shí)是常見現(xiàn)象,這些細(xì)胞可能是尚未完全貼壁或者正處于分裂期的細(xì)胞,無需對(duì)此特殊處理。
 
【注意事項(xiàng)】:

1. Hep G2 [HEPG2]對(duì)培養(yǎng)條件要求較嚴(yán)格,特別是 pH 值和血清質(zhì)量,否則可能影響細(xì)胞凝集數(shù)量,應(yīng)使用高質(zhì)量低內(nèi)毒素,未滅火的胎牛血清,可以幫助圓形的細(xì)胞叢簇更好的貼壁及形成單層細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)容易有空泡,特別是在融合時(shí),這屬于正常現(xiàn)象。
2. 該細(xì)胞部分團(tuán)塊生長,復(fù)蘇后可能存在形態(tài)不典型的情況,經(jīng)幾次傳代后,上皮細(xì)胞形態(tài)會(huì)更加典型。
3. 該細(xì)胞對(duì)血清質(zhì)量較為敏感,我司建議您使用優(yōu)質(zhì)胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)或選擇訂購我司配套MEM完全培養(yǎng)液。
4.另我司提供Hep G2無血清專用培養(yǎng)基,歡迎咨詢訂購。

【發(fā)表過的文獻(xiàn)】
截至到2024年,引用中喬新舟該細(xì)胞發(fā)表過的文獻(xiàn)總數(shù)72篇,總的影響因子467.07,最高影響因子27.5.數(shù)據(jù)如下:
 
下面列舉了幾篇代表性的文獻(xiàn),可以參考:
1.論文題目:Dienediamine: A safe surrogate for the herbicide paraquat
期刊: Molecular Plant 影響因子:27.5
2.論文題目:Photodegradation of carbon dots cause cytotoxicity
期刊:Nature Communications 影響因子:14.919
3.論文題目:Ubiquitin-specific protease 1 facilitates hepatocellular carcinoma progression by modulating mitochondrial fission and metabolic reprogramming via cyclin-dependent kinase 5 stabilization
期刊:CELL DEATH AND DIFFERENTIATION 影響因子:13.7
4.論文題目:Site-specific ubiquitination of VDAC1 restricts its oligomerization and mitochondrial DNA release in liver fibrosis
期刊:EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE  影響因子:12.8
5.論文題目:Accumulation of nanoplastics in human cells as visualized and quantified by hyperspectral imaging with enhanced dark-field microscopy
期刊: ENVIRONMENT INTERNATIONAL 影響因子:11.8
發(fā)布者:上海中喬新舟生物科技有限公司
聯(lián)系電話:021-56760351
E-mail:hufangqiong@zqxzbio.com

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