組織乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

組織乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過乙酰膽堿酯酶反應系統中釋放出巰基膽堿，使用Ellman試劑后，產生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產物，出現吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動物、人體等）乙酰膽堿酯酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又稱為紅細胞膽堿酯酶（RBC cholinesterase），廣泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在腦組織、神經肌肉連接處（neuromuscular junction）、中樞神經系統的膽堿能突觸（cholinergic synapses）和紅細胞膜上高度表達，催化主要的神經傳導介質乙酰膽堿的水解反應，產生乙酸和膽堿，終止突觸傳導。其功能在于調節乙酰膽堿作用。神經毒氣，例如有機磷沙林（Sarin），抑制乙酰膽堿酯酶活性，導致神經肌肉癱瘓，最終發生窒息（asphyxiation）。血清乙酰膽堿酯酶濃度顯著降低與有機磷殺蟲劑中毒有關，因此血液檢測是環境污染的重要指標。基于人工合成底物碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide）在乙酰膽堿酯酶的作用下，水解產生乙酸和硫代膽堿（thiocholine），與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析乙酰膽堿酯酶的活性。乙酰膽堿酯酶反應系統為：

    Acetylcholinesterase 

acetylthiocholine iodide        →      acetate  +  thiocholine

DTNB  +  thiocholine  →   TNB +  choline-S-S-TNB

產品內容

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  40毫升

反應液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）       4毫升

陰性液（Reagent F）     2毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

微型臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長412nm，間隔5分鐘，讀數3次（共15分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度；底物液（Reagent E）50℃溫育溶解

• 樣品背景對照測定

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升陰性液（Reagent F）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈） 
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品背景對照（15分鐘讀數－0分鐘讀數）

• 樣品測定

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（15分鐘讀數－0分鐘讀數）

五、計算樣品活性

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數）X 15（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：樣品背景對照和待測樣品
• 分別移取190微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 加入25微升陰性液（Reagent F）到樣品背景對照孔里
• 加入25微升反應液（Reagent D）到待測樣品孔里
• 分別加入25微升底物液（Reagent E）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入10微升待測樣品（20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和15分鐘讀數

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 15（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘

注意事項

• 本產品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作 
• 操作時，須戴手套
• 每個樣品均須背景測定
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關重要
• 加樣后3秒內比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續15分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定15分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 乙酰膽堿酯酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠生成1微摩爾硫代膽堿所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列乙酰膽堿酯酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感