微型化多光子顯微鏡在自由活動動物成像中扮演著日益重要的角色，然而，其實踐應用仍面臨諸多挑戰。多光子顯微鏡優異的光學切片能力導致其景深較淺（3至20µm，由軸向分辨率確定），成像視野通常在1mm²以內。在缺乏引導的情況下，要在跨越數毫米顱窗或梯度變折射率透鏡（GRIN Lens）的三維空間中，快速定位目標感興趣區域（ROI）仍具挑戰性。尤其是對于缺乏經驗的研究者而言，確認ROI并將微型化顯微鏡安裝到小鼠頭部可能耗費數十分鐘甚至數小時，這極大限制了該技術在自由活動動物研究中的進一步應用。

為解決這一問題，開發團隊在早期的工作中將寬場（WF）物鏡與m2PM頭戴式裝置的微型化物鏡（FHIRM-TPM）相結合，創建了用于定位的寬視場熒光成像裝置。然而，由于早期的微型化物鏡的視場有限（約150µm），在幾毫米寬的顱窗內仍難以快速找尋感興趣區域。此外，在切換至m2PM成像時，由于寬視場物鏡的工作距離有限（約37.5mm），需要對光纖進行較大的彎曲，這使得操作更具挑戰性。近期，Zong等人引入了旋轉臺來固定m2PM頭戴裝置，通過角度調整實現與某些特定的腦區更好的對準。盡管取得這些進展，但在三維腦組織中快速定位感興趣區仍存在挑戰，給新研究人員帶來了陡峭的學習曲線。此外，當前m2/3PM的工作距離小于2mm，當使用z軸平臺定位焦平面時，樣本或物鏡極易受損，對經驗不足的用戶尤為明顯。總的來說，亟需開發一種具有增強引導功能的多模態成像平臺，并建立標準化工作流程，以實現對自由活動動物的高效成像。

多模態熒光成像平臺的系統設計
為解決這一問題，開發團隊設計了多模態熒光成像平臺，將寬場熒光導航系統（WF-Nav）與微型化雙光子顯微成像和微型化三光子顯微成像進行了整合。為充分發揮單光子激發的優勢，WF-Nav系統配備了大視場和單細胞分辨率功能，可快速識別指定感興趣區域。一旦定位到目標區域，系統可無縫切換至雙光子或三光子成像，進一步實現高信噪比或深層神經元成像。隨后將m2PM或m3PM探頭固定于小鼠頭部，釋放小鼠進行自由活動成像。

圖1.多模態熒光成像系統設計

寬場熒光導航系統設計
WF-Nav系統由一臺多色大視場寬場顯微鏡和多功能適配器組成。該系統采用三個LED作為激發光源（405nm，473nm，561nm），并配備高數值孔徑的非球面聚光透鏡對LED光束進行準直，每個激發光路均配有相應的濾光片組。為實現大視場導航并為無縫切換多光子鏡組提供充足空間，開發團隊設計了一款長工作距離、低倍率的干式物鏡。該物鏡（3.3x）采用反遠攝設計：前組為兩片膠合雙合透鏡提供負光焦度，后組由單片球面透鏡構成。這種結構將主平面后移以校正色差，在保持數值孔徑的同時實現了超長有效焦距的工作距離，最終達成90mm工作距離的突破性指標，并實現了Φ5.64mm的最大成像視場。

圖2.寬場熒光顯微鏡設計

為實現寬場模式與多光子成像模式間的無縫切換，該團隊設計了一款多功能適配器。該適配器連接寬場物鏡，并在Z軸電動平臺上進行焦距調節。通過標準化的m2/3PM探頭設計，探頭可穩固的安裝在同一支架上，并保證了多光子與寬場模式切換時的齊焦成像。

圖3.多功能適配器與齊焦功能

此款90mm工作距離的物鏡為操作頭件、光纖或加裝可拆卸電動變焦透鏡模塊提供了充足空間。頭件支架安裝在滑動阻力極小（約0.1N）、伸縮距離12 mm的輕型直線滾珠滑軌上，可有效避免物鏡與樣本的碰撞風險。通過更換頭件支架，系統可兼容不同頭件，如mini2P和m3PM。此外，得益于微型化化雙光子顯微鏡的尺寸與可回縮設計，相較于常規臺式物鏡，該系統在大多數方向上提供了更大的觀察角度，從而帶來了更廣的樣本觀察范圍。這一設計顯著提升了樣本的粗定位效率。

圖4.不同物鏡與微型化雙光子顯微鏡觀察角的對比

接下來，開發人員評估了寬場熒光顯微鏡的光學性能與實際應用。對Thy1-YFPH小鼠的腦切片進行成像，可以清晰識別出神經元和軸突。在470nm波長下進行活體鈣離子成像，561nm波長下進行形態學成像，成功捕獲了3804個GCaMP6f標記的神經元以及4650個表達mCherry的小鼠星形膠質細胞。這些結果證明了該寬場顯微鏡具備多色、單細胞分辨率和高通量成像能力，并提供了對感興趣目標區域導航的出色性能。

圖5.微型化寬場顯微鏡高通量成像

標準化微型多光子顯微成像流程建立
為了讓自由活動小鼠中的m2PM成像工作更加順暢，開發人員建立了一套標準化成像流程，以提高自由活動動物中m2PM成像的效率。首先對動物進行病毒注射和外科手術操作，如顱窗植入或GRIN Lens植入，隨后等待2-4周確保病毒充分表達及手術損傷恢復。以某次實驗為例，我們在初級運動皮層（M1）神經元中標記了GCaMP6s和mCherry，隨后將小鼠固定于WF-Nav裝置下的跑步機上。接著通過寬場顯微鏡定位目標感興趣區域并將其對準視野中心。隨后通過適配器切換至m2PM模式，在920nm和1030nm波長下進行雙色雙光子成像，最后對XY軸和焦平面進行精細調整，可以在幾分鐘內確認最終的目標區域。大多數情況下，會將目標焦平面抬高約25µm，以補償水泥收縮導致的焦點偏移，再將Baseplate固定在動物頭部的頭件上，經過約10分鐘的固化后，小鼠即可進行自由活動成像。

圖6.標準化自由活動微型雙光子顯微成像流程