《Science Advances》文獻成果：單波長激發三光子成像信號增強10倍
該研究由Yusaku Hontani、Fei Xia和Chris Xu等人合作完成，發表于《Science Advances》，題為《Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain》。研究團隊來自康奈爾大學應用與工程物理系及生物醫學工程系，長期致力于多光子顯微鏡技術的創新與應用。
重要發現
01傳統多光子成像的技術瓶頸與突破方向
多光子熒光顯微鏡通過長波長光子的非線性激發實現深層成像，其中雙光子顯微鏡（2PM）和三光子顯微鏡（3PM）是主流技術。與2PM相比，3PM憑借更長的激發波長（如1300nm和1700nm）和更高的非線性限制，在深層組織（如小鼠腦海馬區）中具有更強的穿透能力和圖像對比度。
然而，傳統3PM的多色成像面臨核心挑戰：不同顏色熒光分子（如綠色和紅色）的激發光譜差異大，需依賴雙波長（如1300nm和1700nm）分別激發，導致光學系統復雜、總激發功率高，且信號強度因三階非線性效應較弱而受限。
02藍移激發：單波長多色成像的關鍵機制研究團隊發現，紅色熒光分子（如Texas Red、DsRed）的三光子激發光譜峰值可相對于其一光子激發光譜峰值發生藍移（短波長偏移）數百納米。傳統3PM中，1700nm激發對應紅色熒光分子的最低電子激發態（如590nm一光子吸收峰），而在1300nm波段激發時，光子能量可驅動分子躍遷到更高能量激發態（如430nm附近的吸收帶）。
這一藍移激發機制帶來兩大突破：
（1）單波長兼容多色熒光：使用1340nm單一波長，即可同時激發綠色熒光分子（如GCaMP6s）至最低激發態（對應1300nm光學窗口的傳統路徑），以及紅色熒光分子至更高激發態，實現綠色（525nm發射）、紅色（617nm發射）熒光的同步采集。
（2）信號強度顯著增強：在1300nm波段，部分紅色熒光分子（如Texas Red、SR 101）的三光子激發截面比傳統1700nm波段提升10倍以上。例如，Texas Red 在1340nm處的三光子截面達～11×10⁻⁸²cm⁶(s/photons)²，而1700nm處僅為～0.56×10⁻⁸²cm⁶(s/photons)²，信號強度提升約20倍。
PrismPlus轉基因小鼠在1340nm激發下熒光蛋白的多色3P熒光圖像
03小鼠腦內深層多色成像的實驗驗證穿透深度與信噪比（SBR）
在小鼠腦內1150μm深度（海馬區），1340nm激發的SBR達47，分別是1220nm雙光子激發（SBR=0.77）的60倍和1700nm傳統三光子激發（SBR=16）的3倍，接近無背景噪聲的理想成像狀態。
多色成像能力
利用1340nm單波長，成功同時成像GCaMP6s標記的神經元（綠色）、Texas Red標記的血管（紅色）及三次諧波生成（THG，藍色），深度達1200μm；在PrismPlus轉基因小鼠中，進一步實現Cerulean（青色）、EGFP（綠色）、YFP（黃色）、DsRed-Max（紅色）四色熒光的同步采集，驗證了技術的普適性。
光穩定性提升
對比SR101在1340nm和1700nm激發下的光漂白速率，前者的熒光衰減速度降低約50%，表明藍移激發可減少長期成像中的光損傷。
體內小鼠大腦中Texas Red標記血管的多光子圖像
創新與亮點
01突破多色成像的技術壁壘
傳統多光子成像中，多色熒光需依賴雙波長激光源、復雜光路切換及功率疊加，不僅增加實驗成本，還可能因光毒性限制成像時長。本研究通過單波長激發兼容多色熒光分子，無需額外光學組件即可實現綠色、紅色甚至四色熒光的同步采集，簡化了系統復雜度，為實時動態觀測細胞間相互作用提供了可能。
藍移激發不僅拓展了熒光分子的激發路徑，更通過共振增強效應顯著提升三光子截面。例如，當激發波長接近紅色熒光分子二光子激發光譜的長波邊緣（如1340nm接近2×670nm），量子擾動理論預測的共振效應可使激發概率大幅增加。這一機制在保持1300nm波段深穿透能力的同時，將信號強度提升至傳統3PM的10倍以上，突破了長期困擾深層成像的“信號-損傷”平衡難題。
03推動神經科學研究的范式變革
該技術首次實現了小鼠腦內深層（超1000μm）的多色動態成像，可同步記錄神經元活動（GCaMP6s鈣信號）、血管結構（TexasRed標記）及膠質細胞（SR101標記）。例如，在750μm深度成功捕捉到清醒小鼠神經元的自發鈣振蕩，為研究大腦網絡的跨尺度動態提供了前所未有的工具。
總結與展望
多光子熒光顯微鏡技術的革新始終圍繞“更深、更亮、更精準”的目標。該研究通過藍移激發機制，將單波長多色成像與深層穿透能力結合，不僅解決了傳統3PM的技術瓶頸，更開辟了熒光分子激發的新維度——無需依賴新型熒光蛋白或復雜合成，即可通過現有分子的高階激發態實現性能躍升。未來該技術有望在以下方向拓展，結合光纖探針或微型化顯微鏡，實現自由活動動物的腦內動態多色成像，推動神經環路功能研究。與光遺傳學、電生理記錄等技術結合，構建“結構-功能-調控”一體化的研究平臺�；谒{移激發原理，系統性篩選具有高激發截面的熒光分子，進一步優化成像信噪比。
從實驗室到應用，單波長三光子顯微鏡正以其創新性和實用性，為探索生命奧秘打開一扇更明亮的“光學窗口”。隨著技術的普及，我們有望在不久的將來，更清晰地解碼大腦神經網絡的動態圖譜，乃至實時觀測腫瘤微環境、器官發育等復雜生物學過程。
論文信息聲明：本文僅用作學術目的。
Hontani Y, Xia F, Xu C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Sci Adv. 2021 Mar 17;7(12):eabf3531.
DOI:10.1126/sciadv.abf3531.
