我們都知道在實時定量PCR（qPCR）中，可以通過Cq值和標準曲線得出樣本的初始拷貝數。但Cq值與樣品中靶標的拷貝數有關，也會受到PCR反應的效率和儀器檢測靈敏度的影響。高靈敏度的儀器可以減少檢測樣品所需的循環數，節省時間并提高效率；同時也可以減少假陰性的存在。Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統的設計初衷，就是為了高靈敏高性能而生，每個孔配有單獨的激發和發射光纖，可有效提高靈敏度并降低背景噪聲干擾（圖1左）。此外跟同類產品相比，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統使用全孔檢測技術，每個孔可采集約100,000個數據點，使每個qPCR擴增曲線能夠準確、可重復和靈敏地表示熒光強度，從而提高熒光數據的可靠性（圖1右）。
 

▲ 圖1. 高性能光路系統
 

為了進一步表明Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統的靈敏度，與同類產品進行了以下比較實驗：使用酵母的三個RNA靶標進行檢測，分別是高豐度的Actin基因、低豐度的6Y’端粒基因，以及單拷貝的TEL06R端粒基因。
 

材料和方法

從10mL酵母培養液中制備出RNA，將3µg RNA逆轉錄成cDNA作為模板備用。對于Actin，在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統上使用的cDNA按1：20稀釋；其他的cDNA均按1：10進行稀釋。引物如下：

▲ 表1. Actin、6Y’端粒基因和TEL06R端粒基因的引物對
 

采用4個4倍系列稀釋的cDNA模板和一個無模板對照來計算qPCR擴增效率，反應體系和擴增程序如下：

結果和討論

在高豐度Actin和低豐度6Y’端粒基因的檢測中，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統和同類產品的擴增效率非常相似（表2）。然而，在單拷貝TEL06R端粒基因的檢測中，發現同類產品得到的Cq值偏大，位于35-38之間，導致計算出的擴增效率大于200%，不能作為參考數據；Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統則計算得出E=96%（表2）。
 

▲ 表2. 各基因的擴增效率及R2值
 

同時結果表明，盡管Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統的Actin cDNA上樣量僅為同類產品的一半，但Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統的Cq值小于同類產品的Cq值，兩者相差0.65（表3）。針對低豐度的6Y’端粒基因和單拷貝的TEL06R端粒基因，兩者的Cq值差異較大，差值分別是2.25和4.02（表3）。這些結果表明，隨著基因起始拷貝數的減少，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統靈敏度的提高變得尤為重要。

▲ 表3. 各基因的數據對比
 

靈敏度也會直接影響數據的準確度和再現性。隨著PCR循環數的增加，非特異性產物或引物二聚體擴增的可能性也增加。尤其是使用非特異性熒光染料（如SYBR green）檢測PCR產物時，更需要避免過多的循環數。因此，在早期循環中檢測擴增的能力大大提高了數據的可靠性。
 

具有單孔檢測的Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統設計用于最小化背景噪聲和最大化靈敏度，以實現qPCR反應中最高的特異性和精確度。快快申請試用，讓它幫助你優化qPCR實驗吧。