在熒光定量PCR檢測實驗中可以采用多種方法來進行基因的定量。定量的方法也取決于實驗的目標。當實驗者對待測樣品中的核酸的具體拷貝數比較感興趣時，可以選擇絕對定量。如果實驗者關注的是實驗樣本與對照樣本之間的倍數變化，無需精確測定拷貝數，則選擇相對定量。目前相對定量方法適用于大多數基因表達研究，可分析對照樣本和一個或多個實驗樣本中目的基因表達水平的上調或下調。

在此我們將詳細介紹目前使用廣泛且適用于基因表達研究的相對定量方法：2^-ΔΔCq法。首先相對定量也需要仔細規劃，實驗生成的數據是相對豐度，而非確切的基因拷貝數。

相對定量方法--2^-ΔΔCq

2^-ΔΔCq法是一種非常普遍的技術，它比較了包括對照樣本 (如未處理或野生型樣本) 和內參基因 (如看家基因表達) 在內的實驗樣本的結果。采用該方法，可根據檢測樣本和對照樣本中內參基因的Cq來調整相同樣本中的目的基因的Cq。最后得出的ΔΔCq值可用于測定目的基因表達量的倍數差異。具體計算方法如下：

該方法要求內參基因和目的基因具有相一致的擴增效率，并盡可能接近100% 。確定擴增效率的方法是采用同樣的樣本進行梯度稀釋，生成內參基因和目的基因的標準曲線（下圖）。確定內參基因和目的基因的擴增效率是否在90-110%的范圍內，且相互間效率偏差在5%以內。

內參基因的必要性

內參即是內部參照，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。其作用是校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣定量的結果才更為可信。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下不會發生表達改變的基因作內參。理想的內參基因應該滿足以下條件：

① 不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA的擴增；

② 高度或中度表達，排除低表達；

③ 穩定表達于不同類型的細胞和組織(如正常細胞和癌細胞)，而且其表達量是近似的，無顯著性差別；

④ 表達水平與細胞周期及是否活化無關；

⑤ 其穩定的表達水平與目標基因相似；

⑥ 不受任何內源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響。

內參基因的評估，可通過geNorm、BestKeeper、NormFinder、RefGenes 等工具來評估，這是保證結果可靠準確的前提。其次可對候選的內參基因進行qPCR 實驗做進一步的篩選。首選在不同樣本中均穩定表達的內參基因，即比較各樣品中Cq平均值以及Cq值的標準偏差，選擇SD最小的基因作為實驗內參。

Azure Cielo^TM實時熒光定量PCR系統——相對定量示例

1、實驗方法

方法:從組織中提取RNA，逆轉錄成cDNA，以SYBR Green法進行熒光定量檢測。

試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

實驗步驟:提取RNA→cDNA合成→設計特異性引物→qPCR擴增→結果分析。

2、結果計算

Step1:ΔCq值=目的基因Cq–內參基因Cq

Step2:ΔΔCq值=處理樣品ΔCq–對照樣品ΔCq

Step3:最后計算出倍數關系: 2-ΔΔCq值

3、相對表達量結果：

Azure Cielo™實時熒光定量PCR

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