引物篇：普通PCR 和 QPCR 引物異同點
Q問題： 普通PCR 和 QPCR 引物 是否一樣？
A 回答： 二者的設計原則有相同也有不同；
相同處：
• 序列的查找是一致的；
• 序列選取應在基因的保守區段；
• 選取合適的擴增片段大小
• 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對；
• 避免引物自身形成環狀發卡結構；
• Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
• 引物之間的TM相差避免超過2℃；
• 引物的3’端避免出現3個或3個以上連續相同的堿基；
不同處：
Real time PCR 引物
• PCR 產物長度；real-time PCR要求在300bp以內，一般首選80-150bp 之間；
• 多對目的基因同時擴增，文獻上查來的引物條件會不同，需要設計盡可能條件一致的引物；
• 目的基因含量比較低時，需要設計靈敏度比較高的引物；
• 相對電泳法，Real time PCR靈敏度比較高，對引物的要求更高，引物二聚體要少；熔解曲線要求單一產物；
• Real time PCR的目的是進行定量或者相對定量，對擴增的效率有要求；對引物的二級結構要求高；
普通PCR 引物：
• 根據實驗的要求不同，長度一般是從150bp到幾千bp 不等；
• 對二級結構要求沒有real time PCR 高；
• 對擴增效率要求不高；
• 可以選用梯度PCR 儀，選擇不同退火溫度，對引物退火溫度要求不需要一致；
驗證時不同：
引物的特異性（相同點）：
Ø 引物的特異性在使用前用blast 來保證；
不同點：real time PCR
Ø 在實驗結果中通過熔解曲線來驗證；
Ø PCR的特異性產物峰應與引物報告中的PCR product 相差在兩度之內；
普通PCR 通過產物的長度，跑條帶，來鑒別產物的特異性；
Real time PCR 可以通過擴增曲線，熔解曲線分析來鑒別產物的相對量，同時也可以對終產物進行電泳分析，更全面，更科學！
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com