今天我們來(lái)分享一篇2024年美國(guó)威斯康辛大學(xué)麥迪遜分校化學(xué)系的Lloyd M. Smith 和Ying Ge教授為通訊作者的Top-Down proteomics 綜述，該文章聯(lián)合了多位Top-down 領(lǐng)域的專家學(xué)者，發(fā)表于Nature Reviews Methods Primers，系統(tǒng)闡釋了Top-down Proteomics（TDP）的實(shí)驗(yàn)方法，應(yīng)用實(shí)例以及面臨的挑戰(zhàn)。
 
中心法則描述了信息從 DNA 流向mRNA，最終轉(zhuǎn)化為執(zhí)行生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)的過(guò)程。大量的 proteoforms 形成了化學(xué)性質(zhì)多樣的蛋白質(zhì)家族。proteoforms 的產(chǎn)生源于翻譯后修飾（PTMs）、RNA 可變剪接以及遺傳變異（圖 1a）。因此，全面了解 proteoforms 對(duì)于理解生物系統(tǒng)以及建立基因型和表型之間的聯(lián)系至關(guān)重要。然而，可能存在的 proteoforms 數(shù)量遠(yuǎn)超基因數(shù)量，這帶來(lái)了分析上的挑戰(zhàn)。目前，Top-Down 蛋白質(zhì)組學(xué)（TDP）已經(jīng)成為了全面研究蛋白分子形式的最強(qiáng)大技術(shù)，它通過(guò)Top-Down質(zhì)譜（TDMS）實(shí)驗(yàn)，不需要酶切，直接分析完整的蛋白質(zhì)，以提供 proteoforms的全局視角。TDMS 實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確的完整分子質(zhì)量測(cè)量（“top” 部分）和氣相分子的可控碎裂（“down” 部分）。與TDP不同，Bottom-up蛋白質(zhì)組學(xué)（BUP）需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行充分酶解，得到通常小于 3 kDa 的肽段。目前 BUP 比 TDP 應(yīng)用更廣泛，因?yàn)殡亩伪鹊鞍踪|(zhì)更易于分離、電離和碎裂。然而，BUP 存在固有的局限性，每個(gè)蛋白質(zhì)只能檢測(cè)到有限數(shù)量的肽段，且蛋白質(zhì)序列覆蓋率通常較低。這導(dǎo)致在繪制序列變異和翻譯后修飾圖譜時(shí)，proteoforms 信息及其關(guān)聯(lián)性會(huì)丟失。BUP 的另一個(gè)局限性是無(wú)法推斷不同 proteoforms 上修飾的不同組合。捕捉這種組合信息對(duì)于理解 proteoforms 的功能和調(diào)控至關(guān)重要（圖 1b）。
 
樣品制備與對(duì)照
樣品制備是 TDP 的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)提取方法使用 Good緩沖液，這類緩沖液含有高濃度鹽（>100 mM）、蛋白酶和磷酸酶抑制劑，以及表面活性劑，用于總蛋白質(zhì)的溶解。然而，這些常規(guī)試劑往往與 TDP 不兼容，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾蛋白質(zhì)離子的檢測(cè)并抑制質(zhì)譜信號(hào)。因此，為獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，必須去除這些物質(zhì)。不兼容的鹽和小分子可通過(guò)超濾管離心或使用尺寸排除色譜(SEC)離心柱去除。由于信號(hào)抑制，表面活性劑對(duì)下游質(zhì)譜分析構(gòu)成特殊挑戰(zhàn)。目前，可裂解表面活性劑已被開(kāi)發(fā)出來(lái)，如可酸降解的Rapigest、ProteaseMAX、MaSDeS；可光降解的Azo；可氧化還原降解的N-十二烷基二硫-β-d-麥芽糖苷等。另外，前端分餾和富集策略可在質(zhì)譜分析前從復(fù)雜生物樣品中選擇性分離亞蛋白質(zhì)組，提升低豐度 proteoforms 的檢測(cè)效率。
 
儀器設(shè)備
自上而下方法需要三個(gè)主要步驟（圖 2）：電離（從目標(biāo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生可在質(zhì)譜儀中傳輸?shù)臍庀嚯x子）、通過(guò) MS1 對(duì)電離蛋白質(zhì)進(jìn)行完整質(zhì)量分析、完整氣相碎裂以產(chǎn)生序列信息產(chǎn)物離子（通過(guò) MS2）；以及數(shù)據(jù)處理（包括數(shù)據(jù)庫(kù)搜索），用于 proteoforms 的鑒定、表征和定量。
高質(zhì)量分辨率對(duì) TDP 尤為重要，因?yàn)橥暾�蛋白質(zhì)產(chǎn)生的碎片離子可能形成復(fù)雜的質(zhì)譜圖，其中不同電荷狀態(tài)的各種離子可能部分重疊。許多現(xiàn)代質(zhì)譜儀能夠可靠地實(shí)現(xiàn)高分辨率，包括傅里葉變換質(zhì)譜系統(tǒng)（如離子回旋共振（FTICR）和軌道阱（Orbitrap）質(zhì)譜儀），以及飛行時(shí)間（TOF）和四極桿飛行時(shí)間（QTOF）儀器。  
完整蛋白的分離
蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性對(duì) TDP 構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)，需要在質(zhì)譜分析前對(duì)完整蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。當(dāng)處理較大的蛋白質(zhì)（≥30 kDa）時(shí)，這一挑戰(zhàn)尤為突出。早期使用了基于凝膠電泳的分離技術(shù)，如二維凝膠電泳分離、虛擬二維凝膠質(zhì)譜平臺(tái)、PEPPI-MS等。還可以通過(guò)SEC（尺寸排阻色譜）、RPLC（反相液相色譜）、HIC（疏水相互作用色譜）、IEX（離子交換色譜）的方法分離。盡管新的完整蛋白質(zhì)分離方法發(fā)展迅速，但沒(méi)有單一方法能夠完全分離目標(biāo)蛋白質(zhì)組中的所有物質(zhì)。多維液相色譜（MDLC）通過(guò)結(jié)合多種分離模式，為提高 TDP 的分辨率提供了可能。另外，毛細(xì)管電泳 - 質(zhì)譜（CE-MS）的最新進(jìn)展使其能夠作為變性和非變性分離技術(shù)用于 TDP。離子淌度質(zhì)譜（IMS）基于分子在電場(chǎng)作用下的氣相運(yùn)輸性質(zhì)和碰撞截面積（CCS）分離蛋白質(zhì)，高分辨率 IMS 有望快速分離具有高度序列同源性的 proteoforms。
 
串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)
在 TDP 中，MS/MS 通常包括以下步驟：通過(guò) MS1 分析完整蛋白質(zhì)，選擇前體蛋白離子，將其碎裂為更小的碎片離子，然后分析碎片離子以推導(dǎo)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和修飾（圖3a）。有多種活化/解離方法可用于產(chǎn)生產(chǎn)物離子（圖 3b）。大多數(shù)儀器能進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（CID），通過(guò)與中性氣體分子（如氮?dú)饣驓鍤猓┫嗷プ饔卯a(chǎn)生的碰撞活化，生成b/y離子。紅外多光子解離（IRMPD）涉及低能紅外光子的吸收，可產(chǎn)生b/y離子；當(dāng)吸收多個(gè)光子時(shí)，可能產(chǎn)生次級(jí)及更高階的碎片離子，從而提供更豐富的蛋白質(zhì)序列信息。基于電子的解離方法（ExD），如電子捕獲解離（ECD）和電子轉(zhuǎn)移解離（ETD），在產(chǎn)生高序列覆蓋率方面通常優(yōu)于 CID。ExD 會(huì)產(chǎn)生c/z離子，可用于可靠的proteoforms 表征和翻譯后修飾定位。使用 193 nm 或 213 nm 激光，紫外光解離（UVPD）會(huì)產(chǎn)生更復(fù)雜的串聯(lián)質(zhì)譜圖，其序列覆蓋率與 ExD 方法相當(dāng)或更高。  
數(shù)據(jù)采集
數(shù)據(jù)采集的關(guān)鍵考量包括選擇合適的高分辨率儀器和方法，以提供適當(dāng)?shù)姆宸直媛�、分析分離度、靈敏度以及串聯(lián)質(zhì)譜的覆蓋深度。這些評(píng)估步驟對(duì)于改進(jìn)下游精確完整質(zhì)量的計(jì)算，以及解析具有特殊和組合翻譯后修飾（PTMs）的 proteoform，或難以通過(guò)色譜法分離的單氨基酸取代的 proteoform 至關(guān)重要。目標(biāo)是在整個(gè)觀測(cè)質(zhì)量范圍內(nèi)獲得單位質(zhì)量分辨率，并對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)分子離子進(jìn)行同位素分辨。最常見(jiàn)的 TDP 數(shù)據(jù)采集方法是數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）。數(shù)據(jù)非依賴采集方法（DIA） 正在_bottom-up 蛋白質(zhì)組學(xué)（BUP）工作流程中快速發(fā)展和應(yīng)用 ，同時(shí)也為 TDP 帶來(lái)了令人期待的機(jī)遇。
 
原始數(shù)據(jù)解讀與可視化
受同位素、電荷狀態(tài)對(duì)儀器信噪比（S/N）的影響，以及人類蛋白質(zhì)組 10⁸–10¹²的高動(dòng)態(tài)范圍和寬質(zhì)量范圍，完整蛋白質(zhì)譜圖分析難度大，低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)困難。譜圖解卷積是簡(jiǎn)化 TDP 數(shù)據(jù)的關(guān)鍵步驟，可將復(fù)雜的同位素和電荷狀態(tài)分布轉(zhuǎn)換為單一單同位素質(zhì)量。對(duì)于同位素分辨譜圖，多數(shù)工具依賴 Averagine 模型進(jìn)行去同位素化和理論同位素分布預(yù)測(cè)。質(zhì)譜在液相色譜梯度上連續(xù)采集，precursor常以多種電荷狀態(tài)存在，提取離子色譜圖和多個(gè)電荷狀態(tài)峰的額外信息有助于譜圖解卷積。譜圖未達(dá)同位素分辨時(shí)，可利用多種電荷狀態(tài)離子推導(dǎo) proteoform 的平均中性質(zhì)量 。TDP 譜圖的高復(fù)雜性需專門軟件提取分子信息。目前正持續(xù)開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜數(shù)據(jù)存儲(chǔ)文件格式，最通用的是 mzML（最新版本1.1.1），由人類蛋白質(zhì)組組織蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)倡議（HUPO-PSI）支持。
 
數(shù)據(jù)分析
TDP 數(shù)據(jù)分析流程始于自上而下的質(zhì)譜預(yù)處理和解卷積，生成解卷積質(zhì)譜圖用于 proteoform 譜圖匹配（PrSMs）。下一步是將解卷積質(zhì)譜圖與蛋白質(zhì)或 proteoform 序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，以鑒定具有假發(fā)現(xiàn)率（FDR）控制的 proteoform 并表征翻譯后修飾。最后對(duì) proteoform 豐度定量，鑒定樣品間差異豐度的 proteoform。TDP 工作流程通常分為靶向工作流程（基于對(duì)單個(gè)或一組蛋白質(zhì)的先驗(yàn)知識(shí)指導(dǎo)分析）和發(fā)現(xiàn)工作流程（對(duì)可能的 proteoform 和修飾狀態(tài)知之甚少）。
質(zhì)譜圖與候選 proteoform 的匹配通常先經(jīng)快速過(guò)濾將候選數(shù)量從數(shù)千減至數(shù)十，再用較慢匹配方法確定匹配分?jǐn)?shù)。已有多種 TDP 譜圖鑒定過(guò)濾方法，匹配參考序列時(shí)，串聯(lián)質(zhì)譜的前體質(zhì)量會(huì)與數(shù)據(jù)庫(kù)中 proteoform 或其片段的分子質(zhì)量匹配。含可變翻譯后修飾時(shí)用多缺口搜索，允許多個(gè)前體質(zhì)量差異。允許質(zhì)量偏移時(shí)，常用序列標(biāo)簽、open search策略和未修飾蛋白質(zhì)片段方法。過(guò)濾得到的候選 proteoform 會(huì)與譜圖比對(duì)，鑒定含可變翻譯后修飾或質(zhì)量偏移的 proteoform。
 
proteoform 的鑒定與表征
TDP能全面洞察 proteoform 圖譜，使鑒定、新proteoform的發(fā)現(xiàn)和深入的序列表征成為可能。TDP 可表征組合翻譯后修飾及多基因家族中不同基因編碼的異構(gòu)體（常具高度序列同源性）。例如，肌節(jié)蛋白有多種異構(gòu)體和翻譯后修飾，TDP 可研究單個(gè)肌細(xì)胞的 proteoform 變化。當(dāng)單個(gè)蛋白質(zhì)分子上存在多種翻譯后修飾時(shí)，TDP 是唯一能解析復(fù)雜 proteoform 和組合翻譯后修飾的技術(shù)。如組蛋白是與 DNA 相關(guān)的高度修飾結(jié)構(gòu)蛋白，具多種翻譯后修飾并以多種異構(gòu)體存在，TDP 是解析其復(fù)雜性并定量描述分子化學(xué)計(jì)量的關(guān)鍵工具。
 
proteoform 的定量
與 BUP 類似，TDP 有三種定量方法：label-free（利用 proteoform 強(qiáng)度定量）、同位素標(biāo)記（通過(guò)差異同位素標(biāo)記定量）和化學(xué)標(biāo)記（用化學(xué)報(bào)告分子定量，通常在 MS2 水平）。其他標(biāo)記技術(shù)，如氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)、同量異位（isoabric）標(biāo)記、假同量異位（pseudoisobaric）標(biāo)記和NeuCode SILAC已經(jīng)顯示出定量TDP的潛力。
 
統(tǒng)計(jì)分析與誤差計(jì)算
TDP的軟件通常會(huì)使用E值和P值來(lái)反映串聯(lián)質(zhì)譜和蛋白分子形式的匹配程度，此外FDR值也常被用來(lái)描述鑒定的可靠性。
 
應(yīng)用
 通過(guò)改進(jìn)的方法和平臺(tái)，可繪制多種生物樣品的全局proteoform圖譜。在癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和傳染病等領(lǐng)域，TDP 有助于識(shí)別疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)變體，為疾病機(jī)制研究和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供支持。在生物制藥方面，TDP可用于分析生物治療藥物的結(jié)構(gòu)，如單克隆抗體和抗體 - 藥物偶聯(lián)物，在質(zhì)量控制中發(fā)揮作用。在臨床應(yīng)用方面，TDP已用于病原體鑒定和疾病診斷（如血紅蛋白病、漿細(xì)胞疾病等），但需提升TDP 蛋白質(zhì)組的靈敏度和自動(dòng)化程度以獲得更廣泛的應(yīng)用。
 
面臨的挑戰(zhàn)與優(yōu)化策略
由于諸多新技術(shù)和方法的出現(xiàn)，TDP 發(fā)展迅速。然而，挑戰(zhàn)依然存在：（1）分析樣品有限的生物系統(tǒng)中的 proteoform 需要高分析靈敏度。但實(shí)現(xiàn)高靈敏度是 TDP 面臨的主要挑戰(zhàn)；毛細(xì)管電泳 - 質(zhì)譜（CE-MS）在單細(xì)胞的高靈敏度 TDP 分析中顯示出潛力。nanoPOTS技術(shù)也可用于高靈敏度 TDP。高靈敏度平臺(tái)有潛力加速高靈敏度 TDP 應(yīng)用，使常規(guī)單細(xì)胞 TDP 成為可能。（2）高分子量proteoform 的鑒定；為分析更大的離子，可能需要超高分辨率平臺(tái)，如傅里葉變換離子回旋共振（FTICR）質(zhì)譜儀。在質(zhì)譜分析前，基于SEC或凝膠的技術(shù)，例如整合蛋白質(zhì)組學(xué)方法或 PEPPI-MS可能解決大離子分析的挑戰(zhàn)；（3）一般而言，蛋白質(zhì)序列末端的碎裂效率較高，而中間區(qū)域的碎裂覆蓋率有限。這種差異在較大的蛋白質(zhì)中更為明顯。能夠準(zhǔn)確整合內(nèi)部碎裂的新方法和數(shù)據(jù)分析工作流程可能增強(qiáng)蛋白質(zhì)序列表征和 proteoform 注釋 ；（4）翻譯后修飾（PTMs）的實(shí)驗(yàn)定位和 proteoform 化學(xué)組成的精確表征具有挑戰(zhàn)性。低豐度 proteoform通常受到低靈敏度和不穩(wěn)定的PTMs阻礙。富集策略可以提高低化學(xué)計(jì)量或低豐度信號(hào)；然而，解決不穩(wěn)定 PTMs 通常需要優(yōu)化特定的碎裂方法，例如使用更溫和的基于電子的方法，如ETD或ECD。（5）TDP 相對(duì)較低的通量和較高的數(shù)據(jù)復(fù)雜性是新手和有經(jīng)驗(yàn)的用戶面臨的主要障礙。自動(dòng)制備和分離系統(tǒng)的發(fā)展，以及軟件性能的提升都有助于改善通量的問(wèn)題。
 
展望
TDP是目前唯一能夠確定proteoform 分子形式特征并量化其豐度的技術(shù)。proteoform 的重要性及其作為細(xì)胞、環(huán)境或生物系統(tǒng)健康標(biāo)志物的潛在作用，意味著 TDP 技術(shù)有望繼續(xù)快速發(fā)展。需要解決的兩個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域是改進(jìn)復(fù)雜proteoform 混合物的深度表征和大分子量proteoform 的鑒定和表征。通過(guò)將自上而下的數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)類型（包括基因組和轉(zhuǎn)錄組序列、BUP 和糖組學(xué)）相結(jié)合，存在諸多機(jī)遇。盡管 proteoform 提供了對(duì)細(xì)胞過(guò)程的獨(dú)特見(jiàn)解，但僅憑其自身無(wú)法提供生物學(xué)解釋。需要將 proteoform 與相關(guān)的可測(cè)量輸出(例如轉(zhuǎn)錄物和代謝物)聯(lián)系起來(lái)，并破譯生物學(xué)的基本原理。隨著單細(xì)胞蛋白質(zhì)變體測(cè)量技術(shù)的迅速發(fā)展，相關(guān)技術(shù)將進(jìn)一步拓展。這些令人振奮的多組學(xué)進(jìn)展有望帶來(lái)生物學(xué)預(yù)測(cè)和調(diào)控的新時(shí)代。
 
參考文獻(xiàn)：Roberts, D.S., Loo, J.A., Tsybin, Y.O., et al. Top-down proteomics[J]. Nature Reviews Methods Primers，2024，4(1)：38.

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