人結(jié)腸平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒流程關(guān)鍵點
人結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究胃腸動力障礙、炎癥性腸病及腫瘤微環(huán)境的重要工具。該試劑盒通過優(yōu)化培養(yǎng)基組分與細(xì)胞外基質(zhì)配方，解決了原代細(xì)胞培養(yǎng)中常見的增殖緩慢、表型丟失等問題。
試劑盒核心組分解析
1. 選擇性培養(yǎng)基：含5%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加了TGF-β1（2 ng/mL）和肝細(xì)胞生長因子（HGF），可抑制成纖維細(xì)胞過度生長，同時維持平滑肌細(xì)胞收縮蛋白（如α-SMA、calponin）的表達(dá)。
2. 基質(zhì)膠預(yù)處理板：采用低生長因子Matrigel（稀釋度1:30）包被培養(yǎng)皿，既能促進(jìn)細(xì)胞貼附，又可避免過度分化。用戶需注意解凍后分裝保存，防止反復(fù)凍融導(dǎo)致層粘連蛋白降解。
3. 凍存復(fù)蘇添加劑：含10% DMSO的特定保護(hù)劑中混有ROCK抑制劑（Y-27632），可將復(fù)蘇存活率從常規(guī)方法的40%提升至85%以上。
操作流程關(guān)鍵點
1. 原代分離階段：組織塊貼壁法需嚴(yán)格控制膠原酶IV消化時間（建議15分鐘間歇振蕩），避免肌纖維斷裂。離心后建議用40 μm細(xì)胞篩過濾，去除未消化的黏膜碎片。
2. 傳代時機(jī)判斷：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%融合時，用含0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液處理3分鐘，立即加入含血清中和液。值得注意的是，第3代后細(xì)胞增殖能力顯著下降，建議凍存?zhèn)溆谩?br /> 3. 功能驗證實驗：推薦通過鈣離子熒光標(biāo)記（如Fluo-4 AM）檢測乙酰膽堿刺激下的鈣瞬變，或采用收縮力測定儀分析細(xì)胞對卡巴膽堿的劑量反應(yīng)曲線。
應(yīng)用場景拓展
最新研究發(fā)現(xiàn)，該試劑盒培養(yǎng)的細(xì)胞可用于構(gòu)建3D腸道類器官共培養(yǎng)模型。例如，與腸神經(jīng)元共培養(yǎng)時，通過添加膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF），可模擬腸神經(jīng)-平滑肌信號傳導(dǎo)，為研究腸易激綜合征提供新平臺。
試劑盒核心組分解析
1. 選擇性培養(yǎng)基：含5%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加了TGF-β1（2 ng/mL）和肝細(xì)胞生長因子（HGF），可抑制成纖維細(xì)胞過度生長，同時維持平滑肌細(xì)胞收縮蛋白（如α-SMA、calponin）的表達(dá)。
2. 基質(zhì)膠預(yù)處理板：采用低生長因子Matrigel（稀釋度1:30）包被培養(yǎng)皿，既能促進(jìn)細(xì)胞貼附，又可避免過度分化。用戶需注意解凍后分裝保存，防止反復(fù)凍融導(dǎo)致層粘連蛋白降解。
3. 凍存復(fù)蘇添加劑：含10% DMSO的特定保護(hù)劑中混有ROCK抑制劑（Y-27632），可將復(fù)蘇存活率從常規(guī)方法的40%提升至85%以上。
操作流程關(guān)鍵點
1. 原代分離階段：組織塊貼壁法需嚴(yán)格控制膠原酶IV消化時間（建議15分鐘間歇振蕩），避免肌纖維斷裂。離心后建議用40 μm細(xì)胞篩過濾，去除未消化的黏膜碎片。
2. 傳代時機(jī)判斷：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%融合時，用含0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液處理3分鐘，立即加入含血清中和液。值得注意的是，第3代后細(xì)胞增殖能力顯著下降，建議凍存?zhèn)溆谩?br /> 3. 功能驗證實驗：推薦通過鈣離子熒光標(biāo)記（如Fluo-4 AM）檢測乙酰膽堿刺激下的鈣瞬變，或采用收縮力測定儀分析細(xì)胞對卡巴膽堿的劑量反應(yīng)曲線。
應(yīng)用場景拓展
最新研究發(fā)現(xiàn)，該試劑盒培養(yǎng)的細(xì)胞可用于構(gòu)建3D腸道類器官共培養(yǎng)模型。例如，與腸神經(jīng)元共培養(yǎng)時，通過添加膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF），可模擬腸神經(jīng)-平滑肌信號傳導(dǎo)，為研究腸易激綜合征提供新平臺。
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