乳腺癌是全世界最常見的一種女性惡性腫瘤。三陰性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）的表達(dá)均為陰性的乳腺癌，約占所有乳腺癌病理類型的15%～20%。本研究發(fā)現(xiàn)，一種經(jīng)雌激素誘導(dǎo)的名為RING finger protein 208 （RNF208）的E3連接酶蛋白，可以經(jīng)泛素化直接降解波形蛋白，從而抑制TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

 

波形蛋白是一種中間絲蛋白，在侵襲性上皮癌中高度表達(dá)，包括乳腺癌，前列腺癌，胃癌，惡性黑色素瘤和肺癌，其表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。波形蛋白的異常表達(dá)僅限于乳腺癌細(xì)胞中的TNBC細(xì)胞，加劇了乳腺癌細(xì)胞的侵襲。

 

RNF208在TNBC中顯著低于管腔型，并且RNF208的低表達(dá)與不良的臨床結(jié)果密切相關(guān)。RNF208的過表達(dá)抑制TNBC細(xì)胞的腫瘤形成和肺轉(zhuǎn)移。從機(jī)制上講，RNF208通過與磷酸化的波形蛋白的Ser39殘基相互作用，促進(jìn)波形蛋白蛋白酶體降解，從而抑制TNBC細(xì)胞的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。

 

01

RNF208過表達(dá)減少腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移—實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

 

驗(yàn)證RNF208在乳腺癌癥進(jìn)展中的生理功能

 

1、首先在體外和體內(nèi)研究RNF208的表達(dá)水平是否影響腫瘤的發(fā)生。結(jié)果表明RNF208過表達(dá)顯著降低了TNBC細(xì)胞的增殖（圖1）。

圖1 RNF208過表達(dá)Hs578T和MDA-MB-231細(xì)胞的倍增曲線

 

2、為了進(jìn)一步測(cè)試RNF208對(duì)體內(nèi)TNBC細(xì)胞致瘤能力的影響，將RNF208-tolu TNBC細(xì)胞皮下注射到免疫缺陷小鼠。RNF208的過表達(dá)顯著減小了TNBC細(xì)胞的腫瘤體積（圖2）。

圖2 將過表達(dá)TNBC的細(xì)胞經(jīng)皮下注射到NOD/SCID小鼠（每組n=6），8周后處死（Hs578和MDA-MB-231），腫瘤大小（上）和腫瘤體積（下）

使用無異源可注射的VitroGel水凝膠VHM01 /TWG003包裹TNBC細(xì)胞進(jìn)行移植。分別比較轉(zhuǎn)染空載體(LPCX)（對(duì)照組），轉(zhuǎn)染RNF208過表達(dá)載體（實(shí)驗(yàn)組）的Hs578T和MDA-MB-231兩種細(xì)胞。在本次小鼠植瘤實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，過表達(dá)RNF208組中的波形蛋白表達(dá)水平降低，腫瘤生長明顯受到抑制。

 

3、此外，細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)降低，而細(xì)胞死亡標(biāo)志物caspase-3在RNF208過表達(dá)的原發(fā)性腫瘤組織中與對(duì)照組織相比增加（圖3）。

 

圖3 原發(fā)性腫瘤組織中表達(dá)Ki67和RNF208 IHC圖像（上），細(xì)胞死亡標(biāo)志物caspase-3表達(dá)對(duì)比（下）

 

02

成瘤能力檢測(cè)試驗(yàn)

 

將TNBC細(xì)胞注射到6周齡NOD/SCID小鼠（每組n=5）。以轉(zhuǎn)移到肺為標(biāo)志，比較對(duì)照組和細(xì)胞受RNF208保護(hù)的實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)移潛能。VitroGel 水凝膠在室溫條件下十分穩(wěn)定，可直接與細(xì)胞懸液混合，在與細(xì)胞混合后數(shù)小時(shí)內(nèi)仍然維持可注射的狀態(tài)。研究者還可以通過直接向細(xì)胞懸液中加入各種添加物，完全掌控培養(yǎng)體系中的營養(yǎng)成分。本研究將TNBC細(xì)胞重懸于1:3 PBS/VitroGel RGD水凝膠溶液中，皮下注射到小鼠體內(nèi)，測(cè)量腫瘤生長（圖4）。
 

圖4 對(duì)照組和注射NF208過表達(dá)MDA-MB-231-Luc的NOD/SCID小鼠（每組n=5）6至8周肺部的生物發(fā)光圖像（左圖），India ink染色肺組織顯示轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)（右上圖），散點(diǎn)圖顯示無轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的數(shù)量（右下圖）

 

結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組RNF208過表達(dá)組中，TNBC細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低。本研究結(jié)果表明RNF208的表達(dá)水平與波形蛋白介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲性癌癥進(jìn)展密切相關(guān)。

 

03

體內(nèi)腫瘤形成和肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：NOD/ShiLtJ-Rag2em1AMC Il2rgem1AMC 小鼠

細(xì)胞系：Hs578T、MDA-MB-231

細(xì)胞外基質(zhì)：水凝膠VitroGel（貨號(hào)：VHM01 /TWG003）

檢測(cè)內(nèi)容：測(cè)量腫瘤大小

研究周期：4-8周

 

體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)：

1)將1×10⁷逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的Hs578T和MDA-MB-231細(xì)胞重懸于1:3 PBS/水凝膠(TheWell Bioscience)溶液中。

2)皮下注射至6周齡雌性NOD/ShiLtJ-Rag2em1AMC Il2rgem1AMC 小鼠（n = 6只/組）中。
3)注射后第4周開始每周監(jiān)測(cè)腫瘤大小，用公式V=(A×B²)/2計(jì)算腫瘤體積，其中V為體積(mm³)，A為長徑(mm)，B為短徑(mm)。

肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：

1)1×10⁶ 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的MDA-MB-231-Luc細(xì)胞通過尾靜脈注射至雌性NOD/SCID小鼠體內(nèi)。
2)注射后4周開始每周監(jiān)測(cè)肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況，采用IVS-200系統(tǒng)(Xenogen Corp)檢測(cè)生物發(fā)光信號(hào)。
3)對(duì)肺組織進(jìn)行染色，計(jì)數(shù)結(jié)節(jié)并進(jìn)行分析。腫瘤組織用10%福爾馬林溶液固定，石蠟塊包埋。用相應(yīng)抗體染色，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。
 

VitroGel水凝膠擁有成分明確、室溫下操作、良好的流變性等特點(diǎn)，已經(jīng)成功應(yīng)用于多種細(xì)胞系的成瘤研究，擁有較高的腫瘤形成效率。

 

圖5  VitroGel水凝膠應(yīng)用于動(dòng)物成瘤案例

參考文獻(xiàn)：

Pang, K., Park, J., Ahn, S.G. et al. RNF208, an estrogen-inducible E3 ligase, targets soluble Vimentin to suppress metastasis in triple-negative breast cancers. Nat Commun 10, 5805 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-13852-5

 

END.

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