循環拉伸是一種可以在貼壁細胞中研究的過程，這些細胞接種在柔性表面上，然后周期性地進行拉伸。這一過程創造了一個動態環境，模擬不斷收縮的器官，如肺、心臟和肌肉組織。多項研究表明，拉伸會激活信號通路。例如，拉伸的肌肉細胞會激活 Nox4 信號通路，并增強核蛋白導入。
 

磷酸化是細胞的一個重要方面。例如，表皮生長因子受體 (EGFR)（質膜上的一種酪氨酸激酶受體）的體細胞突變會導致自身磷酸化和組成型激活，從而導致癌癥中細胞分裂。刺激誘導的信號改變背后的蛋白質磷酸化的特性可能為細胞中生理事件的調節提供重要的見解。近年來，磷酸化蛋白質組學定量分析的最新進展使研究人員能夠研究信號通路的異常調控。
 

肺癌是導致死亡的主要原因。大多數以前的研究都是基于傳統的細胞培養方法。然而，肺細胞在呼吸過程中會周期性地受到機械力的影響。因此，了解肺細胞中誘導的循環拉伸的潛在機制可能對肺癌治療很重要。

基于此，臺灣中央研究院與國立臺灣大學基因體與系統生物學的學位項目進行了相關研究，首先應用磷酸蛋白質組學技術來分析人 A549 肺癌細胞和 IMR-90 肺成纖維細胞中拉伸誘導的磷酸蛋白質組。此外，使用生物信息學工具和統計方法分析了不同的磷酸化蛋白質組學狀態，從而揭示了拉伸誘導的生物功能。
 

在這項研究中，對兩個細胞系應用了短期（15、30 和 60 分鐘）和長期（24 小時）的拉伸。循環拉伸實驗采用 10% 的 CSA 變化和單軸拉伸方向。對收集的蛋白質進行消化和加工，然后使用 TiO2 進行磷酸肽的富集，通過質譜法分析磷酸肽。使用 MaxQuant 軟件對磷酸化蛋白質組數據進行量化和鑒定。最后對拉伸誘導的基因組和磷酸化蛋白質組差異表達基因/蛋白質進行了功能富集。

圖1  循環拉伸誘導的磷酸化蛋白質組學分析的實驗步驟和工作流程
 

一些磷酸位點在兩種細胞系中都表現出對拉伸的敏感性，例如 SEPT9 Ser30 和 Zyxin Ser281。SEPT9 Ser30 的磷酸化促進了 HeLa 細胞中的細胞粘附。先前的研究表明，拉伸會破壞緊密的連接和粘附。SEPT9 Ser30 在 IMR-90 和 A549 細胞中均上調。因此，該實驗認為這種磷酸化有助于細胞對拉伸的反應。
 

同樣，磷酸化的 Zyxin Ser281 與 CDK8 相互作用，從而激活 YAP 介導的有絲分裂。該磷酸位點在兩種細胞系中均顯示下調。其他磷位點顯示出不同程度的改性。據報道，AKT1S1S Ser203 磷酸位點可激活 mTORC 信號通路，從而增強致癌性生長。該磷酸位點在 A549 癌細胞中上調，但在 IMR-90 成纖維細胞中下調。

在功能網絡分析中，發現 A549 和 IMR-90 細胞均富集細胞骨架組織和細胞成分組織。為了深入了解循環拉伸誘導的生物學功能，應用了聚類分析發現，細胞-細胞粘附功能顯示兩種細胞系中六個簇的顯著富集。然后進一步研究了循環拉伸后是否會發生細胞運動，隨后觀察到循環拉伸后的細胞重排。在血管內皮細胞和成纖維細胞中也發現了這種現象。

細胞重排是由機械拉伸誘導的，這種拉伸經常發生在各種細胞類型中，有趣的是，在研究中使用的 A549 和 IMR-90 細胞系中也觀察到了這種現象。細胞重新定向是對循環拉伸的常見反應，與此一致，在涉及絲狀聚合和合成的蛋白質（包括肌動蛋白絲、肌球蛋白和微管）上發現了幾個顯著改變的磷酸位點。研究人員認為這些磷蛋白可能與循環拉伸誘導的細胞重排有關。

此外，實驗發現線粒體和高爾基體的轉運及其生物合成是功能富集的結果。結合拉伸誘導的基因表達和功能注釋，發現與線粒體組織相關的功能是通過循環拉伸調控的。該實驗數據表明，30 分鐘和 24 小時的拉伸可以延長線粒體長度，這可能與 IMR-90 和 A549 細胞的線粒體動力學有關。

圖2  循環拉伸作用下被顯著調控的必需蛋白中幾個磷酸位點可能參與的特定生物學功能。
 

A 微管相關蛋白1B（MAP1B）和谷氨酸受體相互作用蛋白1（GRIP1）之間的相互作用可以減慢線粒體運動。
B 肌球蛋白參與線粒體斷裂。
C 表皮生長因子受體 (EGFR) 信號的激活增強了肌球蛋白 IIA 的活性。
D 在兩種細胞系中，通過循環拉伸激活了幾種粘著斑相關蛋白。粘著斑活性的變化導致細胞重排。

在該研究中，磷酸化蛋白質組數據揭示了響應循環拉伸的細胞類型特異性和常見磷酸化位點。此外，證明了細胞重排是細胞抵抗持續拉伸的一種策略，并表明細胞拉伸可增加線粒體長度。總之，周期性循環拉伸引起的磷酸化水平變化可能為動態細胞拉伸提供新的視角。

參考文獻：Wang WH, Hsu CL, Huang HC, Juan HF. Quantitative Phosphoproteomics Reveals Cell Alignment and Mitochondrial Length Change under Cyclic Stretching in Lung Cells. Int J Mol Sci. 2020 Jun 7;21(11):4074. doi: 10.3390/ijms21114074. PMID: 32517296; PMCID: PMC7312583.
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