本文要點：本文作者系統研究了主發射峰位于近紅外一區（NIRⅠ700-900nm）的生物相容性花菁染料的尾發射區域（>1000nm），篩選出的NIR染料在NIR-II區域具有明亮的尾發射，并具有高量子產率、高摩爾消光系數、排泄速度快和適用于生物偶聯的官能團，從而可用于多種生物模型NIR-II實時成像，有望促進NIR-II生物成像的臨床轉化。
熒光成像是一種被證實的高靈敏度、實時跟蹤生物靶標的方法，最近已擴展到近紅外二區成像（1000-1700nm），相比于近紅外一區（700-900nm），近紅外二區波段的光在生物組織中吸收更少，散射系數降低，此外生物自體熒光也在該波段大大減少。當前這一領域的研究主要集中在納米科學和生物學的交叉領域，為NIR-II納米熒光團的體內生物成像開辟了新的機會，但是，考慮到臨床轉化前景，由于潛在的免疫原性反應，基于納米材料的NIR-II熒光團成像后在體內的保留和積累引起了人們的關注。目前仍無臨床獲批的具有高亮度和生物相容性的NIR-II熒光染料。吲哚菁綠（ICG）作為目前唯一獲得FDA批準的NIRⅠ成像試劑，已經廣泛用于臨床血管造影術和手術灌注評估，IRDye800CW目前正在進行反應性修飾的多個臨床試驗評估，已廣泛應用于NIR-I窗口的蛋白/抗體標記和分子靶向成像，但在NIR-I區域成像深度仍然有限。利用目前臨床批準的或商業化的NIRⅠ花菁染料的尾發射進行NIRⅡ成像是個很有前景的思路，然而，對其尾部發射機理的研究還未進行過，本文作者就此展開對尾發射機理的研究。NIRⅠ的熒光發射并不遵守Franck-Condon原理，同時由于硅檢測器對超過900nm的光探測效率低下，因此大于900nm的發射光譜并未產生肩峰，作者通過系統研究篩選出可生物共軛的NIRⅠ染料IR-12N3，其在NIRⅡ區具有明亮的尾發射峰，并對該染料進行了NIRⅡ尾發射機理研究。作者認為，NIRⅠ花菁染料在S1激發態下π域的不對稱導致扭曲的分子內電荷轉移（TICT）過程，被確定為引起明亮的NIR-II發射的原因。利用NIR-II區域的出色亮度，與NIR-I成像相比，高對比度和高信噪比的靶器官和腫瘤深層組織成像得以實現，在小鼠體內施用IR-12N3可以實現非常清晰的血管成像和深部淋巴結成像。
作者首先對一系列市售的NIR-I染料的相對量子產率進行了篩選，發現花菁染料如IR-12N3、ICG和IRdye800是最亮的NIR-I染料，在血清中具有明亮的尾部發射，所有的商用NIR-I花菁染料都可以簡化為四種類型的母核結構，如下圖1a所示，典型的花菁染料有兩個吲哚基和交錯的乙烯鍵，不同的取代基允許控制發色團的性質，如吸收波長、光穩定性、熒光和溶解度，就以IR-12N3為例，這些NIR-I染料具有較強熒光，其發射峰位于800nm左右（圖1b），由于硅基探測器的探測效率較低，在發射光譜的長波長處缺少肩峰。隨后作者使用InGaAs探測器記錄超過900nm的發射光譜，檢測到了合理的尾發射峰（圖1c）。由于這些染料和蛋白質之間具有較強的相互作用，作者測試了牛血清白蛋白（BSA），胎牛血清（FBS）和PBS中熒光強度隨溫度的變化，結果顯示IR12N3-FBS復合物實現了最優的亮度增強（圖1d），在FBS中，IR-12N3的亮度分別比IRDye800和ICG高2到3倍（圖1e）。為了系統研究這種尾發射的現象，作者進行了密度泛函理論（DFT）和時間相關DFT計算（圖2a）。母核1（圖2d上方）和母核4（圖2d下方）的最高占據分子軌道（HOMO）和最低未占據分子軌道離域在整個分子骨架上，表明了具有強烈的π-π*局域激發特征。激發態下的母核1的鍵2和鍵4的鍵長以及母核4的鍵2-4的鍵長顯著增加，隨著扭轉角度的增加，展現出了單鍵的特征（圖2b），這更加有利于這些鍵的扭轉，尤其是母核4會更加明顯，但是需要注意的是，4號母核中環己基的空間位阻作用可以阻止沿著鍵4的旋轉，并且比母核1更有利于產生不對稱構型。在基態下分子為平面型，激發態下中間C-C鍵有被拉長的趨勢，因此在S1激發態更加容易扭轉（圖2f），該扭轉會破壞π-共軛骨架的對稱性，結果使得電荷重新分布，，進一步誘導TICT過程（圖2e），對周圍環境更為敏感的TICT -S1態主要通過位于NIRⅡ區的紅移發射從而回歸基態。
圖1：a）商業化花菁素的一般母核結構。母核1：ICG，母核2：IR820和IR830，母核4：IR12-N3、IRDye800、IR783；b)使用硅基探測器測量NIR-I染料(760 nm激發)的吸收和發射，人為地截斷了低能量發射肩峰；c）在InGaAs探測器上測量NIR-I染料的發射 (808激發)具有更高的靈敏度，在NIR-II光譜區域恢復真實的尾發射；d）染料分別與BSA和FBS加熱孵育10min后NIRⅠ亮度增加；e）IR-12N3-FBS復合物的NIRⅠ量子產率是IRDye800 CW/ICG-FBS復合物的2-3倍
圖2：a）ICG母核結構1和IRDey800/IR12-N3的母核結構4；b）理論計算母核1的鍵2鍵長和母核4的鍵3鍵長與扭轉角度的變化曲線；c）模擬的母核1和母核4的熒光發射波長隨扭轉角度的變化曲線；d）母核1（上）與母核4（下）的HOMOs與LUMOs示意圖；e）母核1（上）與母核4（下）的靜電勢面示意圖；f）尾發射和扭轉分子內電荷轉移(TICT)示意圖。
參考文獻
Zhu, Shoujun, Hu, et al. Repurposing Cyanine NIR-I Dyes Accelerates Clinical Translation of Near-Infrared-II (NIR-II) Bioimaging[J]. Advanced Materials, 2018.
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紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS
NIR-II in vivo imaging system
高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm
高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優于3um
熒光壽命 - 分辨率優于 5us
高速采集 - 速度優于1000fps （幀每秒）
多模態系統 - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區熒光成像、原位成像光譜，CT等
顯微鏡 - 紅外二區高分辨顯微系統，兼容成像型光譜儀
