--基因治療與AAV--
 

基因治療是指將外源正常基因?qū)�入靶細胞，以糾正或補償缺陷和異常基因引起的疾病，從而達到治療目的。所有基因療法都利用病毒或非病毒載體將DNA或RNA輸送到宿主細胞中。與非病毒載體（如陽離子脂質(zhì)或化學載體）相比，病毒載體感染宿主細胞的效率更高，但同時它們可能具有免疫原性副作用。因此，在開發(fā)藥物時，選擇合適的病毒載體是至關(guān)重要的組成部分。腺病毒相關(guān)病毒(Adenovirus Associated Virus，AAV)AAV是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染。腺相關(guān)病毒（AAV）作為一種安全有效的載體，目前已應用于多個臨床試驗。


 

臨床研究項目中AAV1和AAV2約占50%

-質(zhì)量控制--

Wes全自動定量Western Blot

在AAV生產(chǎn)過程中，使用SDS-PAGE通過Western Blot來鑒定蛋白。然而，傳統(tǒng)的Western Blot手動操作繁瑣，重復性差，并且僅是半定量，不宜用于工業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制。Wes全自動定量western以其獨特優(yōu)勢逐漸替換傳統(tǒng)western blot，可用于新型AAV衣殼的表達到下游制造全程質(zhì)量控制中。
 

鑒定衣殼蛋白VP1/2/3

篩選抗體

檢測動態(tài)范圍

將市售AAV2（1x10¹³ GC/mL，33.8μg/mL）進行從1：8至1：256的2X倍比稀釋，Wes檢測VP1/VP2/VP3。

Maurice表征AAV電荷異質(zhì)性

與所有治療藥物一樣，基因療法，需要表征包裝藥物的遞送載體電荷等。使用全柱成像毛細管等電聚焦電泳法（icIEF）來表征AAV的電荷異質(zhì)性，可以確保產(chǎn)品的穩(wěn)定性和一致性。

Maurice兼具CE-SDS和iCIEF雙功能。兩種功能均入選國家藥典。

自發(fā)熒光和紫外吸光度比較

Maurice同時兼具紫外吸光度和自發(fā)熒光檢測通道。與吸收檢測相比，自發(fā)熒光的靈敏度高3-5倍，可以更好檢測出AAV特征性異構(gòu)體峰。因而自發(fā)熒光模式更適合AAV病毒電荷表征。

Intra-assay CV
AAV2和AAV6樣品一式四份進樣，檢測Intra-assay重現(xiàn)性（圖2）。結(jié)果顯示其高重現(xiàn)性：AAV2和AAV6的％RSD分別為3.95％和4.30％（表1）。
Inter-assay CV

AAV6樣品三次獨立實驗，每次實驗三次重復，來檢測Inter-assay重現(xiàn)性（圖3）。％RSD為6.6％（表2）。

變性AAV蛋白電荷表征

AAV病毒蛋白會進行幾種翻譯后修飾，包括糖基化和脫酰胺作用。應激引起的病毒蛋白脫酰胺作用可能導致載體活性，衣殼裝配和轉(zhuǎn)導效率降低¹。icIEF方法通常用于監(jiān)測由唾液酸化，糖基化和脫酰胺作用誘導的單克隆抗體的電荷異質(zhì)性，因此對AAV病毒蛋白也進行類似的評估。使用一式三份電泳圖疊加使用吸光度和自發(fā)熒光檢測法進行評估，AAV2電荷變異體可以清晰分辨和重現(xiàn)（圖4）。

靈敏度及線性

將變性的AAV2從〜3 x 10¹² GC/mL連續(xù)滴定至〜3 x 10¹¹ GC/mL（圖6）以建立方法的靈敏度。該滴定范圍內(nèi)觀察到很強的線性相關(guān)性，R²為0.9956。

監(jiān)測AAV顆粒穩(wěn)定性

對完整的AAV樣品進行溫度壓力測試，以確定是否可以使用Maurice監(jiān)測病毒載體的穩(wěn)定性或衣殼蛋白脫酰胺。

AAV6顆粒非常穩(wěn)定，在37°C或50°C下保持10分鐘完整無缺。但是，當AAV6顆粒在60°C下10分鐘時，不穩(wěn)定。

監(jiān)控AAV批間差

利用Maurice icIEF天然熒光監(jiān)測批次間變異，以鑒別病毒載體批間差別。五批不同的AAV6，每批具有不同的基因組含量/mL（GC/mL），Maurice icIEF自發(fā)熒光分析（圖9）。結(jié)果顯示，所有五個批次在pI〜9.25左右均產(chǎn)生相似的峰形。但是，在一批中觀察到了一個較低pI的附加峰，表明該樣品與其他四批樣品不同。

主要參考資料

1. Deamidation of amino acids on the surface of adeno-associated virus capsids leads to charge heterogeneity and altered vector function, AR Giles, JJ Sims, KB Turner, L Govindasamy, MR Alvira, M Lock, JM Wilson, Mol Ther, 2018; 26(12):2848-2862.

2.Dan Wang, Phillip W. L. Tai and Guangping Gao，Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery，Nature Reviews Drug Discovery, 2019

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