原代細胞相對普通傳代細胞要難轉染，但用對了試劑一樣可以擁有很高的轉染效率和實驗結果，下面以RFect為例，簡單介紹下原代細胞轉染的操作步驟和注意事項。

原代細胞轉染操作步驟（以24孔培養板為例）：
A. 細胞接種：轉染前一天接種細胞，每孔500 μl培養基（不可加抗生素），使細胞在轉染時密度在30-50%。
B. siRNA-RFectPM混合物準備：
1.6pmol siRNA 用50μl無血清培養基稀釋。
2.2μl RFectPM用50μl無血清培養基稀釋。輕輕混勻，室溫孵育5min。注意：確保在25 min內執行第三步操作，不要過于延遲。
3.孵育5min后，將siRNA 稀釋液與RFectPM稀釋液混合（總體積100μl）。輕輕混勻，室溫孵育20 min。
C. 將混合物加到培養的細胞內（完全培養基培養）：
1.將100μl混合物加入培養孔內，培養孔內含有0.5ml培養的細胞。輕輕晃動培養板，混勻。
2.37°C培養18-72h，檢測基因抑制效果。如果需要，細胞培養4-6h時可以更換培養基，但不是必須。孵育時間的長短，取決于細胞類型、
所干擾基因本身及分析方法。可設置不同的孵育時間進行實驗以確定最佳孵育時間。
轉染實驗優化: 為了提高轉染效率，最好對轉染條件進行優化，特別是首次使用。例如：24孔培養板，調整 siRNA與RFectPM試劑的用量。siRNA用量在0.6-30 pmol (final concentration 1- 50 nM)之間調整，RFectPM試劑用量在1.0 - 3.0μl之間調整。

原代細胞轉染實驗要點：
轉染過程不可添加抗生素，否則會導致細胞死亡；
首次實驗siRNA的用量設置在終濃度10nM、30nM、50nM、100 nM進行摸索 ，后續實驗根據實驗結果修改。

RFectPM可用來轉染siRNA、antisense RNA、microRNA等200bp以內的小分子RNA和DNA，可轉染絕大多數原代細胞。對于大多數原代細胞，RFectPM的細胞轉染陽性率都在80%以上，而轉染細胞死亡率不到10%。RFectPM的使用也極其簡便，先將sRNA與RFectPM室溫混合，再將siRNA-RFectPM混合物直接加入含培養基的細胞，血清對轉染效果沒有影響，不必刻意添加或更換培養液。

使用RFect 系列小核酸轉染試劑做siRNA/miRNA轉染測實驗注意事項：
1.細胞接種：一般做轉染前一天接種/鋪板（細胞計數大約5*10^4cell/ml），使做轉染前細胞密度在30-50%；如果細胞是原代細胞，接種密度可以密一些，細胞計數在2*10^6cell/ml；懸浮細胞可以在轉染當天接種/鋪板（細胞計數大約5*10^4cell/ml），待細胞狀態穩定后做轉染前細胞密度30-40%。
2.為了能在使用時有較好的轉染效果，第一次使用建議您用24孔板做，每孔2ul轉染試劑即可。將最佳轉染條件（siRNA與轉染試劑的用量、比例）放大到對應的孔板即可。
3.設置siRNA終濃度10nM,30nM,50nM,100nM四個梯度，每個梯度最好做2-3個復孔（至少2個復孔，避免實驗誤差）。
4.用來稀釋siRNA和稀釋轉染試劑的培養基必須是無血清培養基，因為血清的存在會干擾siRNA與轉染試劑的混合，并且影響轉染效率。
5.檢測方法：轉染后48h收細胞做qPCR基因水平檢測或者轉染后72h收細胞提蛋白做western Blotting蛋白水平檢測。

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