這篇應(yīng)用文章介紹了如何利用Molecular Devices公司的具有化學(xué)發(fā)光的微孔板讀板機進行相應(yīng)檢測，儀器和試劑盒組合簡單易操作，進行相應(yīng)檢測時表現(xiàn)出很高的靈敏度。兩種類型的檢測試劑盒均可在Molecular Devices公司推出的具有化學(xué)發(fā)光的微孔板讀板機進行相應(yīng)的檢測實驗，獲得較優(yōu)的結(jié)果。

優(yōu)勢

- 靈敏、可靠的支原體檢測方式
- 簡單、易操作、可快速獲得檢測結(jié)果
- 檢測結(jié)果簡單、明了

簡介

支原體是目前已知最小的原核生物，是一種常見于哺乳動物細胞培養(yǎng)中污染源。支原體污染讓細胞培養(yǎng)人員付出很大代價，因為它們改變了受污染細胞的形態(tài)、活力和代謝特征。通過顯微鏡很難在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)支原體。目前針對這種情況的污染需要一種靈敏可靠的檢測方法，傳統(tǒng)的支原體污染物檢測方法如耗時標(biāo)記法和繁瑣的PCR等，檢測結(jié)果也很難得到準(zhǔn)確分析。

MycoAlert支原體檢測試劑盒和MycoAertPLUS檢測試劑盒均來自Lonza Walkersville有限公司，此試劑基于生化反應(yīng)配合具有發(fā)光功能微孔板讀板機來檢測某種支原體酶活力。這些酶的存在提供了一種快速篩選過程，可以非常靈敏的對測試樣品進行支原體污染檢測。MycoAert PLUS作為下一代的檢測試劑盒，較上一代標(biāo)準(zhǔn)版試劑盒具有更高光量子輸出效率，化學(xué)發(fā)光讀板機獲得更寬的動態(tài)學(xué)范圍，無論是培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)基上清、水均能進行相應(yīng)檢測。兩種試劑盒的程序步驟一致。

第一步首先將MycoAlert試劑加入細胞培養(yǎng)上清液中，裂解支原體觸發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，如圖一所示；第二步，有活力的支原體被裂解并釋放出能與MycoAlert底物反應(yīng)的酶，催化ADP 轉(zhuǎn)化為ATP，通過檢測樣品中加入MycoAlert底物前后ATP的水平，可以得到其比值并指明支原體是否存在。如果這些酶不存在，那么第二次的讀數(shù)將不會增加。(MycoAlert的Ratio＜0.9和MycoAert PLUS的Ratio＜1.0)，如果樣品陽性的話，其第二次檢測值高于第一次，Ratio＞1.2，如圖二所示為檢測流程。

材料：

- MycoAlert Mycoplasma Detection Kit(Lonza cat. #LT07-318)
- MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit (Lonza cat. #LT07-710)
- MycoAlert Assay Control Set(Lonza cat. #LT07-518)
- 96-well polystyrene solid white plates(Greiner cat. #655075)
- 微孔板讀板機
- SpectraMax i3 多功能微孔板讀板機
- SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機
- SpectraMax Paradigm多功能微孔板讀板機
- SpectraMax M5 多功能微孔板讀板機
- FilterMax F5 多功能微孔板讀板機
- SpectraMax L 微孔板讀板機

方法

MycoAlert和MycoAlert PLUS試劑盒基本原理一致，但是其兩種試劑盒檢測濃度動態(tài)學(xué)范圍不同，詳細信息如下，每種試劑盒在使用當(dāng)天進行試劑配置。

MycoAlert陽性質(zhì)控樣品稀釋關(guān)系如表一所示，100 μL系列稀釋的MycoAlert陽性質(zhì)控樣品加于白色96-孔發(fā)光多孔板中做3個重復(fù)。100 μL MycoAlert試劑(溶于MycoAlert緩沖液中)加于每個孔中并在室溫下孵育5分鐘。孔板置于發(fā)光型微孔板讀板機中，使用SoftMax? Pro 軟件(讀數(shù)A)的讀取所選孔的讀數(shù)。100 μL的MycoAlert底物(溶于MycoAlert緩沖液)立即加入到每個孔中并在室溫下孵育10分鐘。孔板置于發(fā)光型微孔板讀板機中進行檢測，所選孔的讀數(shù)(讀數(shù) B)。儀器設(shè)置見表二。

結(jié)果

我們利用Lonzede公司的MycoAlert試劑盒針對所有發(fā)光型微孔板讀板機進行靈敏度評價，針對于MycoAlert試劑盒質(zhì)控樣品在1:8稀釋倍數(shù)關(guān)系時獲得Ratio＞1.2，而針對于MycoAlertPLUS試劑盒質(zhì)控樣品在1:1000稀釋倍數(shù)關(guān)系時可獲得Ratio＞1.2。

所有的MolecularDevices公司推出的發(fā)光功能的微孔板讀板機均能獲得超過預(yù)期的靈敏度，我們列舉了利用SpectraMaxi3x多功能微孔板讀板機和兩種試劑盒檢測數(shù)據(jù)值，如圖三所示；而表三顯示所有MolecularDevices的微孔板讀板機對陽性樣品稀釋至最低比率關(guān)系也可檢測到Ratio＞1.2的信息情況。

結(jié)論

結(jié)果顯示所有Molecular Devices公司具有發(fā)光功能的微孔板讀板機均能夠滿足此試劑盒的檢測要求，并獲得靈敏的檢測結(jié)果；Molecular Devices微孔板讀板機結(jié)合MycoAlert試劑盒，能夠靈敏、迅速的檢測支原體含量，確保及時檢測到污染物，節(jié)省后期實驗的寶貴時間。