前言

監(jiān)測對細(xì)胞周期變化的影響對于腫瘤的發(fā)展及藥物研發(fā)有著重要的作用。例如，已知抑制有絲分裂的化合物大都用來減緩腫瘤細(xì)胞的生長。活細(xì)胞高內(nèi)涵的篩選已被驗(yàn)證可以區(qū)分細(xì)胞的每個周期。此技術(shù)結(jié)合BacMam轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，可使細(xì)胞表達(dá)兩種細(xì)胞周期相關(guān)熒光融合蛋白。

延時(shí)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)持續(xù)2-3天，細(xì)胞置于ImageXpress^®Micro高內(nèi)涵成像與分析系統(tǒng)的環(huán)境控制艙室中，整個實(shí)驗(yàn)都可維持活細(xì)胞的正常生長環(huán)境。按預(yù)先設(shè)置的時(shí)間間隔，同時(shí)獲取明場和熒光的活細(xì)胞圖像。這個完整的實(shí)驗(yàn)方案包括了預(yù)置模塊對延時(shí)拍攝的圖片進(jìn)行分析，基于明場的圖像識別所有細(xì)胞，基于熒光蛋白的表達(dá)區(qū)分不同的細(xì)胞周期。

可視化熒光蛋白表明細(xì)胞所處周期

使用實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞周期Premo^TM FUCCI細(xì)胞周期指示劑(Thermo Fisher)。在種板之前，細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，geminin和Cdt1。Geminin為綠色的GFP，Cdt1為紅色RFP，拍攝通道分別為FITC和TRITC。由于geminin和Cdt1都只在特定的周期表達(dá)，因此，他們在細(xì)胞核中的表達(dá)可以指示細(xì)胞所處的細(xì)胞周期(圖1)。

優(yōu)勢

- 活細(xì)胞在儀器內(nèi)持續(xù)生長觀察長達(dá)72小時(shí)以上
- 減少實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間
- 明場無標(biāo)記下識別細(xì)胞
- 應(yīng)用細(xì)胞周期轉(zhuǎn)染試劑檢測周期變化

方法

1.準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，40,000細(xì)胞/mL的Hela細(xì)胞懸液與30顆粒/細(xì)胞濃度的FUCCI試劑混合，以4,000細(xì)胞/孔的濃度種在96孔板中，孔板置于37°C，5%CO2的環(huán)境下貼壁8小時(shí)。
2.不同濃度的有絲分裂抑制劑處理細(xì)胞，然后孔板放入ImageXpressMicro系統(tǒng)。
3.每隔2-3小時(shí)系統(tǒng)自動拍攝一次圖片，使用20倍PlanApo物鏡，同時(shí)獲取明場及兩個熒光通道FITC和TRITC的圖像。實(shí)驗(yàn)持續(xù)48-72小時(shí)，細(xì)胞可完成1-2次分裂。
4.分析延遲實(shí)驗(yàn)圖像使用MetaXpress?高內(nèi)涵成像與分析軟件的用戶自定義模塊。

明場識別細(xì)胞，熒光蛋白區(qū)分細(xì)胞周期

活細(xì)胞使用FUCCI細(xì)胞周期指示劑，化合物處理后細(xì)胞周期的變化可以被實(shí)時(shí)監(jiān)測到，比終點(diǎn)法檢測固定細(xì)胞能得到更多的信息。轉(zhuǎn)染了FUCCI細(xì)胞周期指示劑的Hela細(xì)胞在高內(nèi)涵細(xì)胞中實(shí)時(shí)拍攝了圖像，并通過MetaXpress^®高內(nèi)涵成像與分析軟件的模塊進(jìn)行分析，明場下識別出所有細(xì)胞，基于熒光蛋白表達(dá)區(qū)分出不同周期。表達(dá)紅色為G 1期，表達(dá)綠色為G 2/M期，同時(shí)表達(dá)紅色和綠色的為S期(圖2)。處于G0期的細(xì)胞沒有熒光信號，但是會在明場下被識別到并計(jì)入細(xì)胞總數(shù)中。另外，分裂的細(xì)胞也可被記錄。

細(xì)胞周期抑制劑可引起細(xì)胞停滯在特定周期

分析過程可使用MetaXpressPowerCore并行處理軟件加速分析速度。經(jīng)過24小時(shí)化合物處理，大部分細(xì)胞停留在G0期，只有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)了細(xì)胞周期標(biāo)記蛋白。被紫杉醇和諾考達(dá)唑的細(xì)胞有一定的細(xì)胞停滯在G2/M期(圖3)。

總結(jié)

Premo^TMFUCCI細(xì)胞周期指示劑結(jié)合配置環(huán)境控制的ImageXpressMicro成像系統(tǒng)和MetaXpress軟件，可實(shí)現(xiàn)高效的活細(xì)胞周期精確測量。高通量篩選技術(shù)可為科學(xué)家提供一個快速的、自動的基于圖像定量分析細(xì)胞周期的方法，并能夠完整的記錄長時(shí)間內(nèi)的細(xì)胞周期變化。另外，MetaXpress軟件能夠在明場圖像識別細(xì)胞，避免了染料對活細(xì)胞的毒性。同一標(biāo)準(zhǔn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的定量分析方法可評價(jià)多化合物在不同濃度對細(xì)胞周期影響的相關(guān)參數(shù)。