1、什么是瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)？

課前熱身，了解的同學(xué)請(qǐng)直接進(jìn)入題2

瞬時(shí)表達(dá)：外源片段不能隨細(xì)胞分裂而一同復(fù)制，導(dǎo)致表達(dá)時(shí)間短暫，且表達(dá)量隨時(shí)間逐漸下降。

穩(wěn)定表達(dá)：是指外源片段整合入細(xì)胞基因組中，并能隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳遞下去，表達(dá)量長(zhǎng)時(shí)間處于穩(wěn)定水平。

那穩(wěn)定株，顧名思義當(dāng)然是屬于穩(wěn)定表達(dá)的體系了。

2、我的實(shí)驗(yàn)是否需要篩選穩(wěn)定株？

能夠達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)的方法不止穩(wěn)定株一種哦。我們使用慢病毒感染細(xì)胞，也一樣可以達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)的效果。什么原理呢？

*慢病毒是整合型的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，感染細(xì)胞后，攜帶的外源片段會(huì)直接整合入細(xì)胞的基因組DNA中，并能夠隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳代。所以對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞周期、凋亡、增殖等功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，甚至裸鼠成瘤等長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，只要細(xì)胞感染效率較高（70%～80%以上），感染一次慢病毒就可以達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間、高效的基因操作的目的，滿足實(shí)驗(yàn)要求，無(wú)須篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。

3、細(xì)胞感染效率較高（70%～80%以上），臣妾做不到啊，難感染的細(xì)胞怎么辦？

少年，恭喜你選擇了hard模式。那就趕緊召喚穩(wěn)定株吧。那么問(wèn)題來(lái)了，選擇何種方式將外源片段整合入細(xì)胞基因組中呢？

質(zhì)粒（常規(guī)轉(zhuǎn)染/電轉(zhuǎn)）：這種方法介導(dǎo)的整合幾率和中500w彩票差不多哦😱(<<10^-6)，且整合進(jìn)入的片段大小是隨機(jī)的，常常不是丟了西瓜（目的基因）就是少了芝麻（抗性基因），導(dǎo)致假陽(yáng)/陰性率高。

慢病毒：攜帶的外源片段在病毒重組酶的作用下直接整合入細(xì)胞的基因組DNA中，因此效率與質(zhì)粒相比要高多個(gè)數(shù)量級(jí)。而且整合片段是固定的，目的基因和抗性基因終于可以手牽手一起走啦。

下面幫大家整理了利用抗性基因進(jìn)行篩選的標(biāo)準(zhǔn)流程。

*藥篩法關(guān)鍵在于藥物作用濃度和時(shí)間的確定，這點(diǎn)根據(jù)細(xì)胞的不同需要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，還要保證在篩選出穩(wěn)定株的同時(shí)藥物不會(huì)對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)產(chǎn)生不良影響。

➢常用抗性篩選標(biāo)志物：新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418來(lái)代替新霉素進(jìn)行選擇性篩選。

篩選抗生素的推薦使用濃度（μg/ml）

💣此處有坑請(qǐng)注意：大部分細(xì)胞株是群居“動(dòng)物”，需要同類的陪伴才能正常生長(zhǎng)哦，若是不幸落單，則生長(zhǎng)緩慢或者索性不長(zhǎng)，再努力也拿不到單克隆株呢。

4、那么問(wèn)題來(lái)了，同樣是穩(wěn)定株，單克隆？混合克隆？傻傻分不清楚～要怎么選？

單克隆穩(wěn)定株：來(lái)源于含有穩(wěn)定整合外源片段的單個(gè)細(xì)胞的擴(kuò)增。

混合穩(wěn)定株：由多個(gè)單克隆穩(wěn)定株混合構(gòu)成的克隆群，不同的單克隆其外源片段的整合位點(diǎn)不一樣。

由于不同細(xì)胞基因組背景存在差異，且不同整合位點(diǎn)的單克隆細(xì)胞株表現(xiàn)出來(lái)的細(xì)胞表型可能不一致，所以使用混合克隆株更能去除細(xì)胞間差異造成的干擾，否則需要對(duì)多個(gè)單克隆穩(wěn)定株進(jìn)行比較，才能獲得更精確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

為了去除細(xì)胞間差異，得到更精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推薦您使用慢病毒感染，或者構(gòu)建混合克隆穩(wěn)定株！

● 感染效率70%～80%以上即可直接實(shí)驗(yàn)，不會(huì)受到質(zhì)疑

● 高分低分文獻(xiàn)都使用混合克隆，國(guó)際承認(rèn)

● 篩選單克隆株至少要用兩株細(xì)胞來(lái)去除細(xì)胞間差異，工作量翻倍，不劃算

比如下面這篇5分文章，花了2個(gè)月構(gòu)建穩(wěn)定株，再吭哧吭哧把細(xì)胞功能學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都做了兩遍。不但要保證兩個(gè)單克隆株目的基因表達(dá)量一致，功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果也要類似哦！要是不一致怎么辦？換一株再重復(fù)呀，真是給自己挖了一大坑！

5、穩(wěn)定株構(gòu)建不出來(lái)，怎么辦？可誘導(dǎo)表達(dá)的穩(wěn)定株：TET-on慢病毒系統(tǒng)

下面兩種情況，常規(guī)的穩(wěn)定株構(gòu)建式比較困難的，但是辦法總比困難多

1）過(guò)表達(dá)：看基因功能。如果是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，那么是很難構(gòu)建穩(wěn)定株的（目的基因感染細(xì)胞后就會(huì)凋亡或不長(zhǎng)）。

2）干擾：建議構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)的穩(wěn)定株。RNA 干擾敲減的是細(xì)胞內(nèi)源在用的基因，敲減后，短時(shí)間內(nèi)會(huì)看到抑制效果，但時(shí)間長(zhǎng)了后，細(xì)胞內(nèi)會(huì)有調(diào)控機(jī)制將被抑制的基因上調(diào)表達(dá)，甚至超過(guò)常規(guī)的量。

這兩種情況下，建議病毒感染細(xì)胞后直接做功能實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。如果要做穩(wěn)定株需要用TET-on慢病毒系統(tǒng)。

那什么是TET-on系統(tǒng)？具體如何使用呢？

我們下期見(jiàn)！